RA滑膜マクロファージにおける変異型葉酸レセプターβの発現異常の解析

RA滑膜巨噬细胞突变型叶酸受体β异常表达分析

• 批准号: 12770232
• 负责人: 松下 紀子
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770232/
• 关键词: 慢性関節リウマチ; マクロファージ; 葉酸レセプター

私達は慢性関節リウマチ(RA)滑膜マクロファージ系細胞に葉酸レセプター(FR)-βが過剰に発現し、高頻度に突然変異を起していることを見出した。突然変異のおこる原因やメカニズムについては不明な点が多いが、発作性夜間血色素尿症に見られる様な体細胞突然変異を予想している。今年度は以下の項目を目的として研究を行った。(1)この突然変異はRA滑膜マクロファージ系細胞に特有か。(2)新しい変異型FR-βの検索。(3)突然変異はクローナルなレベルで起こるのか。(4)変異型FR-β発現THP-1細胞株を樹立する。まず(1),(2)に関して、RA滑膜マクロファージ系細胞5例、変形性関節炎(OA)滑膜マクロファージ系細胞5例、LPSで刺激した健常人の末梢血単核球3例について、Pfu DNA polymeraseを用いたRT-PCR、塩基配列の決定を行った。その結果、RA、OA、LPSで刺激した健常人の末梢血単核球にそれぞれ4/55,2/25,1/29クローンに突然変異がみられた。このことから、FR-βに高頻度に起こる突然変異は炎症性マクロファージに特異的であることが示唆された。(3)について私達は、炎症部位に存在する細胞が活性酸素やNOを産生し、近位部の骨髄細胞の分裂時に作用してクローナルなレベルで体細胞突然変異がおこることを予想している。そこでRA炎症近位部の骨髄細胞を得、M-CSF/GM-CSF添加培地中にてミエロイドコロニーを形成後、Genomic DNAを得た。2組の蛍光標識プライマーを用いてNested PCR、SSCPを行い、exon3、4について検討した結果、72個中9個のミエロイドコロニーに変異がみられた。これらのコロニーについては現在検討中である。(4)に関しては、野生型FR-βを発現したTHP-1細胞株を5株樹立しており、同様に変異型FR-βを発現したTHP-1細胞株を樹立し、その機能を検討する予定である。

我们发现叶酸受体（FR）-β在类风湿性关节炎（RA）滑膜巨噬细胞中过度表达且频繁突变。尽管突变的原因和机制尚不清楚，但我们预测体细胞突变与阵发性睡眠性血红蛋白尿症相似。今年，我们进行了以下研究目标。 (1) 这种突变是RA滑膜巨噬细胞特有的吗？ (2)寻找新的突变体FR-β。 (3) 突变是否发生在克隆水平？ (4)建立表达突变FR-β的THP-1细胞系。首先，关于(1)和(2)，进行使用DNA聚合酶的Pfu RT-PCR和碱基序列测定。结果，在接受 RA、OA 和 LPS 刺激的健康受试者外周血单核细胞克隆中，分别观察到 4/55、2/25 和 1/29 克隆发生突变。这表明 FR-β 中频繁发生的突变是炎症巨噬细胞特有的。关于(3)，我们预测存在于炎症部位的细胞会产生活性氧和NO，它们在近端区域的骨髓细胞分裂期间起作用，导致克隆水平的体细胞突变。因此，从RA炎症的近端区域获得骨髓细胞，在补充有M-CSF/GM-CSF的培养基中形成骨髓集落后，获得基因组DNA。使用两组荧光标记引物进行巢式 PCR 和 SSCP，检查外显子 3 和 4 的结果是，在 72 个骨髓集落中的 9 个中观察到突变。这些殖民地目前正在接受调查。关于(4)，我们已经建立了5个表达野生型FR-β的THP-1细胞系，并且类似地建立了表达突变型FR-β的THP-1细胞系，并且我们计划这样做。