ブタ腎臓上皮細胞の細胞内cAMP濃度を上昇させる新規生理活性ペプチドの解析

一种可增加猪肾上皮细胞内 cAMP 浓度的新型生物活性肽的分析

• 批准号: 12770068
• 负责人: 片渕 剛
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: National Cardiovascular Center Research Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770068/
• 关键词: cAMP; カルトシトニン; CGRP; CTR; CRLR; RAMP; LLC-PK1; カルシトニン

本年度はブタ腎臓上皮細胞由来細胞株LLC-PK_1の細胞内cAMPを上昇させる活性を持つ新規生理活性ペプチド生理作用の検討を行った。まず第一段階としてこの新規生理活性ペプチドの受容体に対する特異性の検討を行った。構造上の類似性等今までに得られた知見より本ペプチドがカルシトニン(CT)もしくはカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の受容体を活性化している事が予測された。これらの受容体は通常の膜7回貫通型受容体と受容体活性修飾蛋白質(RAMP)とのサブユニット構造により形成されていることが知られているため、カルシトニン受容体(CTR)、カルシトニン受容体様受容体(CRLR)及びRAMP1、2、3のcDNAクローニングを行い、哺乳類発現ベクターに連結した後、COS-7細胞に受容体とRAMPを共発現させてペプチド刺激に対するCOS-7細胞内のcAMP産生量を測定した。その結果、本ペプチドはRAMPの有無に関係なくCTRを発現させるとCOS-7細胞のcAMP産生を強く活性化することが観察された。また反対に、CRLRを発現させた場合では何れのRAMPを発現させた場合でもcAMPの産生は活性化されなかった。以上の結果を踏まえ、この新規生理活性ペプチドをカルシトニン受容体刺激ペプチド(CRSP)と命名した。次に第二段階としてCRSPのin vivoにおける作用の検討を行った。前段階の結果からCRSPは血中カルシウム濃度を調整する活性を持っていると推測されたので、ラットに本ペプチドを静脈内投与して血中カルシウム濃度の変動を調べたところ、カルシトニンと同様に投与後速やかに血中カルシウム濃度が低下することが観察された。また静脈内投与後の血圧変動を調べたところ、CGRPでは一過性の強い血圧低下が見られたのに対し、CRSPでは全く変動が見られなかった。以上の結果から、CRSPは破骨細胞や腎上皮細胞に発現していることが知られているCTRを刺激して、血中カルシウム濃度の調節に関与していることが明らかとなった。

今年，我们研究了一种新型生物活性肽的生理效应，该肽具有增加猪肾上皮细胞来源的细胞系 LLC-PK_1 细胞内 cAMP 的活性。作为第一步，我们研究了这种新的生物活性肽对受体的特异性。根据迄今为止获得的知识，例如结构相似性，预测该肽激活降钙素（CT）或降钙素基因相关肽（CGRP）的受体。已知这些受体由正常的 7 次跨膜受体和受体活性修饰蛋白 (RAMP) 的亚基结构形成。克隆 LR) 和 RAMP1、2 和 3 的 cDNA 并将它们连接到哺乳动物表达载体后，我们在 COS-7 细胞中共表达受体和 RAMP，并测量 COS-7 细胞中响应肽刺激而产生的 cAMP 量。 做过。结果发现，无论 RAMP 是否存在，当 CTR 表达时，该肽都会强烈激活 COS-7 细胞中的 cAMP 产生。相反，当CRLR表达时，无论表达哪种RAMP，cAMP的产生都不会被激活。基于上述结果，这种新的生物活性肽被命名为降钙素受体刺激肽（CRSP）。接下来，作为第二步，我们研究了 CRSP 的体内作用。根据上一步的结果，推测CRSP具有调节血钙浓度的活性，因此当将此肽静脉注射给大鼠并研究血钙浓度的变化时，发现它具有调节血钙浓度的活性。与降钙素具有相同的活性，给药后立即观察到血钙浓度降低。此外，当研究静脉内给药后的血压变化时，CGRP观察到血压短暂性强烈降低，而CRSP则没有观察到血压变化。上述结果表明，CRSP可刺激CTR，已知CTR在破骨细胞和肾上皮细胞中表达，并参与调节血钙水平。

项目成果

Y.Tomoda: "Cardiac fibroblasts are major production and target cells of adrenomedullin in the heart in vitro."Cardiovascular Res.. 49. 721-730 (2001)

Y.Tomoda：“心脏成纤维细胞是体外心脏中肾上腺髓质素的主要产生细胞和靶细胞。”心血管研究 49. 721-730 (2001)

Tomoda, Y.: "Regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells"Peptides. 22. 1783-1794 (2001)

Tomoda, Y.：“培养细胞肾上腺髓质素分泌的调节”肽。