DMAHP/SIX5の標的遺伝子の同定による筋緊張性ジストロフィーの病態解明

通过鉴定 DMAHP/SIX5 靶基因阐明强直性肌营养不良的病理学

• 批准号: 12770075
• 负责人: 佐藤 滋
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770075/
• 关键词: 筋緊張性ジストロフィー; ホメオボックス遺伝子; 転写制御; IGFシグナリング; 筋分化; アデノウイルス; 遺伝子欠損マウス; DNAアレー; 白内障; マイクロアレー

SIX5遺伝子の発現量低下と筋緊張性ジストロフィー1型(DM1)病態との関わりを明らかにするためには、転写因子SIX5によって発現が制御される標的遺伝子の同定が不可欠である。今年度は、活性化型Six5(VP16-Six5wt)をアデノウイルスベクターによりP19細胞で過剰発現させ、cDNAアレーを使って同定した標的候補遺伝子の1つ、IGFシグナル制御因子をコードするIgfbp5遺伝子について詳細な解析を行った。まずIgfbp5遺伝子プロモーター上のSix5結合部位をレポータージーン解析、種々のin vitro結合実験により明らかにした。Six5は進化的に保存されたGCTCAAATTGCという配列(転写開始点の上流-72bpに位置する)に結合することがわかった。既知の標的遺伝子(myogenin、Atpla1)との比較からSix5結合コンセンサス配列(TCARRTTNC)を提唱することができた。またSix5欠損マウス繊維芽細胞におけるIgfbp5の発現レベルは1/2以下に低下しており、生体内でもSix5がIgfbp5遺伝子の転写活性化に関与することが確認された。Igf2遺伝子についても同様な結果が得られた。次にDM1患者由来の繊維芽細胞を骨格筋に分化誘導し、その過程におけるIGFBP5遺伝子発現量の変動を調べた。正常細胞では約2倍の発現増加が観察されたが、3種類の患者由来細胞では発現量はいずれも低下しており、IGFBP5遺伝子の制御の様相が変化していることが示された。本研究により中胚葉、体節、骨格筋、いくつかの筋特異的遺伝子、神経系で発現する遺伝子がSix5標的遺伝子として同定された。以上によりSix5はこれら標的遺伝子の制御を介して中胚葉系の組織、神経組織の構築と機能に関わるタンパク質であり、複雑なDM1症状の一部に関与する可能性が強く示唆された。

为了阐明 SIX5 基因表达下降与 1 型强直性肌营养不良 (DM1) 病理学之间的关系，有必要鉴定其表达受转录因子 SIX5 调节的靶基因。今年，我们将使用腺病毒载体在 P19 细胞中过表达激活的 Six5 (VP16-Six5wt)，并了解有关 Igfbp5 基因的更多信息，该基因编码 IGF 信号调节因子，这是我们使用 cDNA 阵列鉴定的目标候选基因之一。进行了详细的分析。首先，通过报告基因分析和各种体外结合实验揭示了 Igfbp5 基因启动子上的 Six5 结合位点。发现 Six5 与进化保守序列 GCTCAAATTGC（位于转录起始位点上游 -72 bp）结合。通过与已知靶基因（肌细胞生成素、Atpla1）的比较，我们能够提出 Six5 结合共有序列（TCARRTTNC）。此外，Six5缺陷型小鼠成纤维细胞中Igfbp5的表达水平降低至一半以下，证实Six5即使在体内也参与Igfbp5基因的转录激活。 Igf2 基因也获得了类似的结果。接下来，我们诱导 DM1 患者来源的成纤维细胞分化为骨骼肌，并检测在此过程中 IGFBP5 基因表达的变化。在正常细胞中观察到表达增加了大约两倍，但在所有三种类型的患者来源细胞中表达水平均下降，表明 IGFBP5 基因的调节发生了变化。这项研究将中胚层、体节、骨骼肌、几种肌肉特异性基因和神经系统中表达的基因确定为 Six5 目标基因。上述结果有力地表明，Six5是一种通过调节这些靶基因参与中胚层组织和神经组织的构建和功能的蛋白质，并且可能参与DM1的一些复杂症状。

项目成果

Sato,S.: "Functional conservation of the promoter regions of vertebrate tyrosinase genes."J Investig Dermatol Symp Proc.. (in press).

Sato,S.：“脊椎动物酪氨酸酶基因启动子区域的功能保护。”J Investig Dermatol Symp Proc..（正在出版）。

Sato, S.: "Identification of transcriptional targets for Six5 : Implication for the pathogenesis of myotonic dystrophy type 1"Hum. Mol. Genet.. (in press).

Sato, S.：“Six5 转录靶标的鉴定：对 1 型强直性肌营养不良发病机制的影响”Hum。

Toyoda,R.: "Pigment cell-specific expression of the tyrosinase gene in ascidians has a different regulatory mechanism from vertebrates."Gene. 259. 159-170 (2000)

Toyoda,R.：“海鞘中酪氨酸酶基因的色素细胞特异性表达具有与脊椎动物不同的调节机制。”基因。

Sato, S.: "Development of pigment cells in the brain of ascidian tadpole larvae : insights into the origins of vertebrate pigment cells"Pigment Cell Res.. 146(6). 428-436 (2001)

Sato, S.：“海鞘蝌蚪幼虫大脑中色素细胞的发育：深入了解脊椎动物色素细胞的起源”色素细胞研究 146(6)。