Ca^<2+>波・Ca^<2+>オシレーションにおける小胞体内Ca^<2+>動態の画像解析

Ca^<2+> 波和 Ca^<2+> 振荡过程中内质网 Ca^<2+> 动力学的图像分析

• 批准号: 12770024
• 负责人: 尾田 正二
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo Women's Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770024/
• 关键词: マウス卵; GFP; ポリアデニル化; ミトコンドリア; 受精; CD9; 小胞体; CAMELEON; in vitro maturation

平成13年度では、小胞体への移行配列を有するCAMELEONをマウス卵に発現させることを試みた。無細胞的にポリAを付加したCAMELEONのRNAを合成し、マウスGV卵に注入した後卵を培養して成熟させた。CAMELEONは発現し卵は蛍光を発するようになったが、発現したCAMELEONは小胞体に移行せず、その存在は小胞体に限局しなかった。同じ移行配列を有するYellow Fluorescent Protein(YFP)を発現させた卵ではYFPは小胞体に移行して小胞体に局在したことから、卵で発現したCAMELEONを小胞体へ局在させるには特別な工夫が必要であると考えられ、その努力を継続中である。マウス卵で発現したCAMELEONの蛍光は十分に明るく、CAMELEONを小胞体へ移行させることさえできれば小胞体内Ca^<2+>濃度の測定は可能であると考えられる。ポリAを付加したmRNAを合成しGV卵に注入する手法を用いて、CAMELEON以外に多くの外来タンパク質をマウス卵に効率的に発現させることができた。精子と卵の融合に関与する膜タンパクであるCD9をノックアウトマウス卵に発現させることにより、融合阻害を回復させることができた。また、CD9とGFPとの融合タンパク質を発現させることにより、受精時のCD9の動態を可視化することができた。さらに予備的な実験ながら、ミトコンドリア移行配列を有するpHプローブタンパク質およびCa^<2+>プローブタンパク質を発現させて、ミトコンドリアのpHとCa^<2+>濃度の動態をモニターすることができた。マウス未受精卵のミトコンドリア内pHは培養細胞のそれと比較して低く、未受精卵でのATP産生が活発でないことが示唆された。また、ミトコンドリア内Ca^<2+>濃度は細胞質Ca^<2+>濃度を反映せず、従来の報告が測定上のアーティファクトである可能性が高いことが示唆された。

2001年，我们尝试在小鼠卵中表达CAMELEON，它具有易位至内质网的序列。以无细胞方式合成添加了polyA的CAMELEON RNA，注射到小鼠GV卵中，并培养卵至成熟。虽然CAMELEON被表达并且卵开始发出荧光，但是表达的CAMELEON没有迁移到内质网并且其存在并不局限于内质网。在表达具有相同易位序列的黄色荧光蛋白(YFP)的鸡蛋中，YFP迁移至内质网并定位于内质网中，因此，需要特殊的程序来将鸡蛋中表达的CAMELEON定位于内质网中。我们认为需要改进，并且我们正在继续努力这样做。小鼠卵中表达的CAMELEON的荧光足够亮，认为如果能够将CAMELEON转移至内质网，则可以测定内质网中的Ca 2+ 浓度。通过使用合成添加polyA的mRNA并将其注射到GV卵中的方法，我们能够在小鼠卵中高效表达除CAMELEON之外的许多外源蛋白。通过在敲除小鼠卵子中表达CD9（一种参与精卵融合的膜蛋白），他们能够逆转融合抑制。此外，通过表达 CD9 和 GFP 的融合蛋白，我们能够可视化受精过程中 CD9 的动态。此外，在初步实验中，我们能够通过表达具有线粒体易位序列的pH探针蛋白和Ca^2+探针蛋白来监测线粒体pH和Ca^2+浓度的动态。未受精小鼠卵的线粒体内 pH 值低于培养细胞的线粒体内 pH 值，表明未受精卵中 ATP 生成不活跃。此外，线粒体内Ca ^ 2+ 浓度不反映胞质Ca ^ 2+ 浓度，表明先前的报告可能是测量伪影。

项目成果

T. Aida, S. Oda, T. Awaji, K. Yoshida, S. Miyazaki: "Expression of a green fluorescent protein variact in mouse oocytes by injection of RNA with an added long poly(A)tail"Molecular Human Reproduction. 7(11). 1039-1046 (2001)

T. Aida、S. Oda、T. Awaji、K. Yoshida、S. Miyazaki：“通过注射添加了长聚 (A) 尾的 RNA，在小鼠卵母细胞中表达绿色荧光蛋白变异体”分子人类生殖。

T. Aida, S. Oda, T. Awaji, K. Yoshida, S. Miyazaki: "A Method for Effieient Expression of a GFP variant in mouse Oocytes"Japanese Journal of Phystology. 51. Suppl. S122 (2001)

T. Aida、S. Oda、T. Awaji、K. Yoshida、S. Miyazaki：“在小鼠卵母细胞中高效表达 GFP 变体的方法”日本生理学杂志。