アサガオ未熟種子に存在するジベレリン応答性加水分解酵素の組織化学的解析

未成熟牵牛花种子中赤霉素响应性水解酶的组织化学分析

基本信息

批准号：
12760074
负责人：
中嶋正敏
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

アサガオ未熟種子中で発現するα-アミラーゼ相同遺伝子(PnAmy1および2)をクローニングした。この内、発現量の多いPnAmy1に焦点を絞り以降の解析を行った。大腸菌発現系を用いて調製したPnAmy1-GST融合タンパク質を用いて活性染色を行った結果、アミラーゼ活性を示した。これによりPnAmy1がα-アミラーゼをコードすることを確認した。mRNA発現解析において、ジベレリン(GA)処理後1-6時間の範囲で明瞭なGA応答能を確認した。抗PnAmy1抗体を用いて行ったウェスタン解析では、種子可溶性画分中のPnAmy1存在量および用いた抗体の特異性からPnAmy1の組織化学的解析が可能と判断し、免疫組織化学を行った。対照区との比較からデンプン粒の存在する珠皮中に特異的染色を検出し、GA局在部位と空間的に合致する結果を得るとともに、GAの局在時期から数日遅れて染色強度が極大に達したため、GAがPnAmy1を直接誘導する可能性が示唆された。一方、PnAmy1のin situ hybridizationでは珠皮よりも種皮付近により強いシグナルを認めたことから、免疫組織化学とin situ hybridizationの手法としての違いに起因する差異であるのか、あるいは転写・翻訳時の産物が移動する可能性なども視野に入れ現在も解析を継続している。本研究で得た情報は、穀類など単子葉植物においては古くから知られている「種子発芽時にGAがひきおこすα-アミラーゼ等加水分解酵素群の誘導とそれに続くデンプンの分解現象」が、アサガオではより早期の生殖成長期である種子成熟過程で同様のカスケードとして機能する可能性を提唱するものであり、今後、この系が他の双子葉植物においても該当する一般的な現象であるのか確認したい。

克隆了在未成熟牵牛花种子中表达的α-淀粉酶同源基因（PnAmy1和2）。其中，我们在后续分析中重点关注高表达的PnAmy1。使用大肠杆菌表达系统制备的 PnAmy1-GST 融合蛋白的活性染色显示淀粉酶活性。这证实了PnAmy1编码α-淀粉酶。在mRNA表达分析中，在赤霉素(GA)处理后1-6小时范围内确认了明确的GA应答能力。在使用抗PnAmy1抗体进行的Western分析中，基于种子可溶级分中PnAmy1的丰度和所使用的抗体的特异性，确定可以对PnAmy1进行组织化学分析，并进行了免疫组织化学。与对照图相比，我们在存在淀粉颗粒的表皮中检测到特异性染色，并获得了与 GA 定位位点空间匹配的结果，并且染色强度在 GA 定位时间后几天下降，达到最大值。 GA可能直接诱导PnAmy1。另一方面，在PnAmy1的原位杂交中，在种皮附近观察到的信号比表皮处的信号更强，因此这种差异可能是由于免疫组化和原位杂交方法的差异，也可能是由于我们目前正在继续分析，考虑到病毒可能移动的可能性。这项研究获得的信息表明，在谷物等单子叶植物中，“种子萌发过程中GA诱导α-淀粉酶等水解酶以及随后的淀粉分解现象”发生在这表明类似的级联可能在种子成熟过程中发挥作用，这是早期的生殖生长阶段，我们想确认这个系统是否也适用于其他双子叶植物。