炭酸固定を触媒する微生物脱炭酸酵素によるCO_2の分子変換

微生物脱羧酶催化碳酸固定对CO_2的分子转化

基本信息

批准号：
12760050
负责人：
吉田豊和
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

脱炭酸酵素は逆反応で炭酸固定を触媒しないとされているが、Bacillus metarerium PYR2910に見いだしたピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素は炭酸固定をも触媒する新規酵素である。ピロールへの炭酸固定活性に注目すると、化学合成では困難な位置特異的な炭酸固定反応を触媒することから、二酸化炭素の分子変換への応用も可能である。しかしながら、ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素の酵素構造・反応機構に関する知見は全くない。一方、類縁の酵素反応を探索をした結果、ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素はSerratia属細菌にも分布していること、インドール3-カルボン酸脱炭酸酵素も可逆的に反応を触媒することがこれまでに明らかとなってきた。そこで、これらの新しい脱炭酸酵素群の分子および反応特性を解明するために、ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニングとその解析を進めた。インドール-3-カルボン酸脱炭酸酵素については、酵素を精製し性質の解明を行った。ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素をB.megaterium PYR2910およびS.grimesii IFO13537から精製し、プロテインシーケンシングによってアミノ酸配列の一部を得た。この配列に基づき、PCRによってそれぞれの部分遺伝子断片を増幅させ、増幅断片をプローブとしてピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素遺伝子をクローニングした。2種類の細菌の酵素一次構造は、これまで機能未知であった数多くの微生物タンパク質と20〜50%の相同性を示し、保存性の高い配列が数ヶ所認められた。近傍領域の解析ではピロールの代謝に関与する遺伝子群は認められなかったが、桂皮酸誘導体の脱炭酸酵素と高い相同性を示すタンパク質がコードされていた。B.megaterium PYR2910の遺伝子を大腸菌内で発現させ、野生型酵素と同じ特性を有することを示した。インドール-3-カルボン酸脱炭酸酵素は極めて酸素感受性であり、反応には不安定なSH基が関与することが示唆された。ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素(ホモダイマー)とほぼ同一のサブユニット分子量を有し、一次構造の類似性が推察されるが、未変性酵素はホモテトラマーであった。精製酵素はインドールへの炭酸固定以外に、数種のインドール誘導体、キノキサリンにも作用し、相当するカルボン酸を生成した。

虽然脱羧酶是逆反应，不催化碳酸固定，但在芽孢杆菌PYR2910中发现的吡咯-2-羧酸脱羧酶是一种也催化碳酸固定的新酶。着眼于吡咯的碳酸固定活性，它可以应用于二氧化碳的分子转化，因为它催化化学合成中难以进行的位置特异性碳酸固定反应。然而，对于吡咯-2-羧酸脱羧酶的酶结构和反应机制尚不清楚。另一方面，通过寻找相关的酶反应，我们发现吡咯-2-羧酸脱羧酶也分布于沙雷氏菌中，并且吲哚-3-羧酸脱羧酶也可逆地催化该反应。迄今为止。因此，为了阐明这些新脱羧酶基团的分子和反应特征，我们对吡咯-2-羧酸脱羧酶基因进行了克隆和分析。关于吲哚-3-羧酸脱羧酶，我们纯化了该酶并阐明了其性质。从巨大芽孢杆菌PYR2910和S.grimesii IFO13537中纯化得到吡咯-2-羧酸脱羧酶，并通过蛋白质测序获得部分氨基酸序列。基于该序列，通过PCR扩增各部分基因片段，并使用扩增片段作为探针克隆吡咯-2-羧酸脱羧酶基因。两种细菌的初级酶结构与众多功能未知的微生物蛋白具有20-50%的同源性，并且观察到一些高度保守的序列。虽然在附近区域分析中没有发现参与吡咯代谢的基因组，但编码了与肉桂酸衍生物脱羧酶表现出高度同源性的蛋白质。巨大芽孢杆菌 PYR2910 基因在大肠杆菌中表达，并显示出与野生型酶具有相同的特性。吲哚-3-羧酸脱羧酶对氧极其敏感，表明不稳定的SH基团参与了该反应。它与吡咯-2-羧酸脱羧酶（同二聚体）具有几乎相同的亚基分子量，表明一级结构相似，但天然酶是同四聚体。除了将碳酸固定在吲哚上之外，纯化的酶还作用于几种吲哚衍生物喹喔啉，并产生相应的羧酸。