哺乳類でのエンドサイトーシス経路とその調節の分子機構の細胞工学的手法による解明

利用细胞工程技术阐明哺乳动物内吞途径及其调控分子机制

基本信息

批准号：
11780521
负责人：
大橋正人
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

哺乳類のエンドサイトーシス後期過程の膜動態とそれを駆動する分子機構には不明な点が多い。これらを解明するために体細胞遺伝学的なアプローチは有力でありうるが、おもに変異株やその復帰変異体を分離分析するための有効な方法の欠如のためこれまで系統的に行われてこなかった。我々は、エンドサイトーシス経路の分子メカニズムを解明するために、セルソーターを用いた独自の工夫により、低密度リポタンパク質のリソゾームでの分解が遅いCHO変異株群を得、それらの解析を行ってきた。これまでに、これらの変異株が、エンドサイトーシス前期過程は正常であるが、後期過程になんらかの異常を持っていること、また、すべてが劣性の変異を持ち、相補性試験の結果、3つの異なる相補群に分類されることを明らかにしてきた。本年度は(1)蛍光観察により輸送系を定量的に解析する方法、および(2)CHO細胞におけるレトロウイルスベクターを介した発現クローニング法を確立した。これらの方法を利用して、変異株の解析を進めることにより、以下の点を明らかにした。第一に、エンドソーム後期過程は遺伝子の変異によって規定される複数の独立膜動過程に分けられ、分子選別過程またはその前過程に関わる一時的なコンパートメントの段階と、分子選別の完了したさらに後期のエンドソームの段階、そしてさらに進んだごく後期のエンドソームとリソゾームの直接相互作用段階が存在することを明らかにした。第二に、これらの後期エンドソーム膜動輸送の特定の進行過程にコレステロールが要求される事を明らかにした。

关于驱动哺乳动物内吞作用后期的膜动力学和分子机制还有许多未知数。尽管体细胞遗传学方法可能有效地阐明这些问题，但迄今为止尚未系统地进行，这主要是由于缺乏分离和分析突变株及其回复体的有效方法。为了阐明内吞途径的分子机制，我们使用细胞分选仪获得了一组低密度脂蛋白在溶酶体中缓慢降解的CHO突变株，并对其进行了分析。到目前为止，我们发现这些突变菌株在早期的内吞过程中是正常的，但在晚期过程中却出现了某种异常，并且它们都具有隐性突变，并且通过互补测试，我们发现： 3 已明确将它们分为不同的互补组。今年，我们建立了（1）利用荧光观察定量分析转运系统的方法，以及（2）利用CHO细胞中的逆转录病毒载体进行表达克隆的方法。通过使用这些方法并对突变株进行分析，我们澄清了以下几点。首先，晚期内体过程可以分为由基因突变决定的多个独立的膜运动过程：涉及分子分选过程或其预处理的临时室阶段，以及分子分选完成的后期阶段。是内体阶段，是内体和溶酶体之间直接相互作用的更高级阶段。其次，我们发现胆固醇是晚期内体膜运输的特定过程所必需的。