哺乳類でのエンドサイトーシス経路とその調節の分子機構の細胞工学的手法による解明

利用细胞工程技术阐明哺乳动物内吞途径及其调控分子机制

基本信息

批准号：
11780521
负责人：
大橋正人
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

哺乳類のエンドサイトーシス後期過程の膜動態とそれを駆動する分子機構には不明な点が多い。これらを解明するために体細胞遺伝学的なアプローチは有力でありうるが、おもに変異株やその復帰変異体を分離分析するための有効な方法の欠如のためこれまで系統的に行われてこなかった。我々は、エンドサイトーシス経路の分子メカニズムを解明するために、セルソーターを用いた独自の工夫により、低密度リポタンパク質のリソゾームでの分解が遅いCHO変異株群を得、それらの解析を行ってきた。これまでに、これらの変異株が、エンドサイトーシス前期過程は正常であるが、後期過程になんらかの異常を持っていること、また、すべてが劣性の変異を持ち、相補性試験の結果、3つの異なる相補群に分類されることを明らかにしてきた。本年度は(1)蛍光観察により輸送系を定量的に解析する方法、および(2)CHO細胞におけるレトロウイルスベクターを介した発現クローニング法を確立した。これらの方法を利用して、変異株の解析を進めることにより、以下の点を明らかにした。第一に、エンドソーム後期過程は遺伝子の変異によって規定される複数の独立膜動過程に分けられ、分子選別過程またはその前過程に関わる一時的なコンパートメントの段階と、分子選別の完了したさらに後期のエンドソームの段階、そしてさらに進んだごく後期のエンドソームとリソゾームの直接相互作用段階が存在することを明らかにした。第二に、これらの後期エンドソーム膜動輸送の特定の進行過程にコレステロールが要求される事を明らかにした。

关于哺乳动物晚期内吞作用过程的膜动力学以及驱动它们的分子机制有许多未知数。阐明它们的体细胞遗传学方法可能是有效的，但由于缺乏隔离和分析突变体及其恢复突变体的有效方法，因此还没有系统地实施。为了阐明内吞作用途径的分子机制，我们获得了一组CHO突变体，它们使用使用细胞分类器独特的Ingenentus在溶酶体中降低了低密度脂蛋白的降低，并分析了它们。到目前为止，这些突变体在入口前的过程中已被证明是正常的，但在以后的过程中有一些异常，并且都具有隐性突变，并且由于互补性测试而被分类为三个不同的互补组。今年，我们建立了（1）一种通过荧光观察来定量分析传输系统的方法，（2）一种通过逆转录病毒载体在CHO细胞中克隆表达的方法。使用这些方法，通过对突变菌株进行分析来阐明以下几点。首先，我们已经透露，晚期内体过程被分为多个由基因突变定义的多个独立的膜运动过程，并且在分子选择或以前的分子选择中涉及暂时的隔室阶段，后来具有完全分子选择的后期阶段，以及在非常晚内体和溶液体之间进行直接相互作用的进一步直接相互作用的先进阶段。其次，已经表明，在这些晚期内体膜动态转运的特定进展过程中，需要胆固醇。