パルスELDOR法を用いた新しいタンパク質構造解析法の開拓

使用脉冲 ELDOR 方法开发新的蛋白质结构分析方法

基本信息

批准号：
11780433
负责人：
三野広幸
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780433/
关键词：
EPR ESR ELDOR PSII Oxygen evolution Photosynthesis histidine-tag Chlamydomonas reinhardtii 光合成構造解析

项目摘要

最近分子間距離を測定する方法としてパルスESR法が大きく発展している。特にパルスESR法の技術の一つであるパルスELDOR法を用いれば長距離のラジカル間距離を高感度で測定することができる。(原理的には150Åまでのラジカル対を1Å以下の精度で観測することが可能)パルスEPRを用いた距離の測定法は非常に有効な方法でありながら測定対象が不対電子間のみに限られるという制約がある。これを測定技術面及び試料の面より改善し新たな方法を開拓するのが本研究の狙いである。一つの解決法として遺伝子操作によるタンパク質アミノ酸の装飾によりタンパク質上の任意の位置に金属の結合サイトを人工的に作成し距離を測定する方法を試みている。この手法をもちいれば遺伝子配列として既知のアミノ酸間の立体構造上での距離を求めることが可能になる。単純に任意のアミノ酸位置についてこのプロセスを繰り返すことにより、アミノ酸位置の相対的な距離は求まると考えられる。本年度はクラミドモナスにhistidine-tag(5つのイミダゾール基の連なったもの)を挿入した試料を大量に作成し、ESR測定に最適なhistidine-tagに配位させる金属の選定を行った。パルスELDOR法を用いて光合成光化学系II内のアミノ酸残基やクロロフィル分子等の位置の特定を行うことができた。

近年来，脉冲ESR法作为一种测量分子间距离的方法得到了极大的发展。特别是，如果使用作为脉冲ESR技术之一的脉冲ELDOR方法，则可以以高灵敏度测量长距离的自由基间距离。（原则上，可以观察高达 150 Å 的自由基对，精度为 1 Å 或更小）虽然使用脉冲 EPR 进行距离测量是一种非常有效的方法，但它仅限于测量不成对电子之间的距离。这是可以做到的。本研究的目的是从测量技术和样品方面对其进行改进并开发新的方法。作为一种解决方案，我们试图通过基因操作修饰蛋白质氨基酸，在蛋白质的任意位置人工创建金属结合位点，从而测量距离。使用这种方法，可以确定基因序列中已知氨基酸之间的三维结构距离。据信，氨基酸位置之间的相对距离可以通过对任何氨基酸位置简单地重复该过程来确定。今年，我们制备了大量插入有组氨酸标签（一系列五个咪唑基团）的衣藻样品，并选择了最适合 ESR 测量的金属来与组氨酸标签配位。使用脉冲ELDOR方法，我们能够识别光合光系统II中氨基酸残基和叶绿素分子的位置。