パルスELDOR法を用いた新しいタンパク質構造解析法の開拓

使用脉冲 ELDOR 方法开发新的蛋白质结构分析方法

基本信息

批准号：
11780433
负责人：
三野広幸
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780433/
关键词：
EPR ESR ELDOR PSII Oxygen evolution Photosynthesis histidine-tag Chlamydomonas reinhardtii 光合成構造解析

项目摘要

最近分子間距離を測定する方法としてパルスESR法が大きく発展している。特にパルスESR法の技術の一つであるパルスELDOR法を用いれば長距離のラジカル間距離を高感度で測定することができる。(原理的には150Åまでのラジカル対を1Å以下の精度で観測することが可能)パルスEPRを用いた距離の測定法は非常に有効な方法でありながら測定対象が不対電子間のみに限られるという制約がある。これを測定技術面及び試料の面より改善し新たな方法を開拓するのが本研究の狙いである。一つの解決法として遺伝子操作によるタンパク質アミノ酸の装飾によりタンパク質上の任意の位置に金属の結合サイトを人工的に作成し距離を測定する方法を試みている。この手法をもちいれば遺伝子配列として既知のアミノ酸間の立体構造上での距離を求めることが可能になる。単純に任意のアミノ酸位置についてこのプロセスを繰り返すことにより、アミノ酸位置の相対的な距離は求まると考えられる。本年度はクラミドモナスにhistidine-tag(5つのイミダゾール基の連なったもの)を挿入した試料を大量に作成し、ESR測定に最適なhistidine-tagに配位させる金属の選定を行った。パルスELDOR法を用いて光合成光化学系II内のアミノ酸残基やクロロフィル分子等の位置の特定を行うことができた。

最近，脉冲ESR方法已开发为测量分子间距离的方法。特别是，使用脉冲Eldor方法，脉冲ESR方法的技术之一可以用高灵敏度测量长距离的异型距离。（原则上，可以观察到高达150Å的自由基成对的精度为1Å或更少）使用脉冲EPR的距离测量方法是一种非常有效的方法，但是有一个限制，即测量对象仅限于未配对电子之间的距离。这项研究的目的是从测量技术和样品中改善这一点，并开发新方法。一种解决方案是通过蛋白质氨基酸的基因工程装饰并测量距离，在蛋白质上的任何位置人为地创建金属结合位点。使用此技术，可以确定称为基因序列的氨基酸之间构象的距离。人们认为，通过简单地重复任何氨基酸位置的过程，就可以确定氨基酸位置的相对距离。今年，我们创建了大量样品，其中组氨酸标签（一系列二咪唑组）被插入衣原体，并选择了与组氨酸标签协调的金属，这是ESR测量的理想选择。可以使用脉冲Eldor方法鉴定光合光合系统II中氨基酸残基和叶绿素分子的位置。