安全で高効率長期遺伝子発現を可能とするアデノーEBハイブリッドベクターの開発

开发腺苷-EB杂合载体，实现安全高效的长期基因表达

基本信息

批准号：
11771476
负责人：
水口裕之
金额：
$ 0.58万
依托单位：
National Institute of Health Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771476/
关键词：
遺伝子治療アデノウイルスベクター EBウイルス

项目摘要

本研究では、安全面を高めたgutlessアデノウイルスベクター(ウイルスDNAの複製とパッケージングに必要な領域以外の全てのアデノウイルス由来のDNAを欠損)に、EB(Epstein-Barr virus)ウイルスの潜伏感染装置であるEBNA1(Epstein-Barr nuclear antigen-1)とOriPの配列を組み込んで、効率が良く安全で長期的な遺伝子発現が可能なハイブリッドベクターの開発を目指している。本年度は以下の結果を得た。1)ハイブリッドベクターを作製するにあたり、まずベクターに組み込むEBNA1とOriP配列の機能を、両配列を有するプラスミドを用いることによって解析した。EBNA1とOriP配列を有するプラスミドは従来ヒトあるいはサル以外の細胞では複製能を有していないと考えられてきたが、ヒト由来HeLa細胞、マウス由来L、NIH3T3細胞、ラット由来C6、L6、RL-34細胞、ハムスター由来CHO、BHK-21細胞で複製能を検討したところ、HeLa細胞だけでなくL、C6、L6細胞において、効率良く複製できることを見いだした。本結果は、EBNA1とOriP配列を組み込んだ環状DNAは、少なくとも一部の齧歯類由来細胞では複製能を持つことを示しており、遺伝子治療への応用を考えたモデル実験を齧歯類で行うにあたり、重要な基盤とるりうると考えられた。2)相同組換え法により大腸菌βガラクトシダーゼ(LacZ)を発現するgutlessアデノウイルスベクターの作製に成功し、gutlessアデノウイルスベクター作製のための最適化条件を決定した。また、LacZ発現について培養細胞で検討した。3)EBNA1とOriP配列、モデル遺伝子としてヒトα1-アンチトリプシン(hAAT)およびゼオシン耐性遺伝子を有したgutlessアデノウイルスベクターを相同組換え法により作製した。

在这项研究中，EB（爱泼斯坦 - 巴尔病毒）病毒被隐藏在无肠腺病毒载体中（源自所有腺病毒的缺陷DNA衍生出源自病毒DNA所需的重复和包装。，通过结合设备EBNA1（Epstein-Barr核抗原1）和Orip的序列，可以安全和启用。今年获得了以下结果。 1）在创建杂化载体时，通过使用具有两个阵列的质粒分析EBNA1和掺入载体的Orip序列的功能。具有EBNA1和ORIP序列的质粒已被认为在人或猴子以外的其他细胞中未重复，而是HeLa细胞，小鼠衍生的L，NIH3T3细胞，大鼠衍生的C6，L6，RL-，RL-，RL-，RL-。在检查了34个细胞，仓鼠衍生的CHO，BHK-21细胞的重复能力之后，我们发现不仅可以有效地复制HeLa细胞，还可以有效地复制L，C6和L6细胞。结果表明，环DNA掺入了EBNA1，Orip序列表明至少某些啮齿动物衍生的细胞具有重复的能力，并且考虑到遗传处理的模型实验是啮齿动物的。这样做的基础。 2）已成功产生了通过同源重组方法表达大肠杆菌（LACZ）的成功的无肠腺病毒载体，并且已经成功地生产了生产无肠腺病毒载体的乐观条件。此外，通过培养细胞检查了LACZ表达。 3）肠道腺病毒载体具有人α1-抗替替金（HAAT）和耐沸石的基因作为EBNA1和ORIP阵列模型基因，是由同性恋重组创建的。