軟骨細胞のメカニカルストレス受容機構における細胞骨格分子と接着分子の相互作用

软骨细胞机械应力受体机制中细胞骨架分子与粘附分子的相互作用

• 批准号: 11771308
• 负责人: 高橋 一郎
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771308/
• 关键词: 軟骨細胞; メカニカルストレス; 細胞接着; フィブロネクチン; II型コラーゲン; 細胞骨格; インテグリン

本研究では,牽引力の負荷に伴う軟骨細胞の線維芽細胞への形態変化とa5b1インテグリン分子の発現の関係を解明することを目的として,これを細胞生物学的に検討する.また,軟骨細胞に対する牽引力の負荷に伴いその分化形質としてのII型コラーゲン及びアグリカンの発現が抑制され,かわって線維芽細胞としての形質、フィブロネクチン及びI型あるいはIII型コラーゲンの発現を獲得する,という仮説を検証する.さらに,この過程にインテグリンによる細胞-細胞外基質間の接着が寄与していることを示す.実験材料として胎齢12日のSD系ラットを用い,四肢胚より細胞を顕微鏡下で採取する.続いてこれにtrypsin-collagenaseで処理を施し,細胞を分離した後,DMEM培地を用い培養した.メカニカルストレスの負荷にはFlexer cellを用いた.細胞の分化指標としてのI型,II型,III型コラーゲンや,アグリカン,フィブロネクチンの発現については半定量的RT-PCR法を用いたmRNAの定量によって行った.また,共焦点レーザー顕微鏡と蛍光抗体間接法を用いた免疫染色による形態観察によって,細胞内骨格と細胞・細胞外基質を接着タンパクであるインテグリンが仲介して作り出す接着斑の形成を経時的に観察した.伸展力を負荷した軟骨細胞よりtotal RNAを抽出し,その後逆転写酵素によりcDNAテンプレートを作製し,半定量的PCR法により目的遺伝子の定量実験を行った.結果、伸展力を加えなかった群に比べ,II型コラーゲンおよびアグリカンの遺伝子発現は10〜20%用量依存的に有意に抑制されることが分かった.また,形態観察により,経時的に接着斑の形成が促進されることが示された.これらのことから、機械的伸展力がラット四肢原器由来軟骨細胞の初期分化を抑制すること,これにはintegrinによる細胞-基質問接着が寄与していることが示唆された.

在这项研究中，我们将研究软骨细胞对成纤维细胞的形态变化与由于牵引力的负载而导致的A5B1整合素分子的表达之间的关系。我们还将研究以下假设：II型胶原蛋白和Aggrecan作为分化性状的表达由于软骨细胞上的牵引力的负载而被抑制，而取得了纤连蛋白和I型或III胶原蛋白的表达。此外，我们表明整联蛋白通过整合素的细胞 - 细胞基质之间的粘附有助于这一过程。使用12天大的SD大鼠作为实验材料从显微镜下从肢体胚胎中收集细胞。接下来，我们用胰蛋白酶 - 胶原酶，分离的细胞和使用DMEM培养基培养它们。屈曲物用于加载机械应力。使用了细胞。通过半定量RT-PCR方法量化了I型，II型，III型胶原蛋白作为细胞分化指标以及Aggrecan和纤连蛋白的表达。此外，随着时间的推移，观察到使用共聚焦激光显微镜和间接荧光抗体方法进行免疫染色来观察形态学观察，以形成由粘附蛋白介导的整合蛋白产生的灶，该粘附蛋白是粘附蛋白。来自带有延伸力的软骨细胞的总数。提取RNA，然后使用逆转录酶制备cDNA模板，并使用半定量PCR进行靶基因的定量实验。结果，发现与不施加延伸力的组相比，II型胶原蛋白和脂蛋白的基因表达以10-20％的剂量依赖性方式得到了显着抑制。此外，形态学观察结果表明，粘附的形成是随着时间的推移而促进的。这些表明，机械延伸力抑制了源自大鼠肢体祖细胞的软骨细胞的早期分化，而整联蛋白基于细胞的询问粘附有助于此。