軟骨細胞のメカニカルストレス受容機構における細胞骨格分子と接着分子の相互作用

软骨细胞机械应力受体机制中细胞骨架分子与粘附分子的相互作用

• 批准号: 11771308
• 负责人: 高橋 一郎
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771308/
• 关键词: 軟骨細胞; メカニカルストレス; 細胞接着; フィブロネクチン; II型コラーゲン; 細胞骨格; インテグリン

本研究では,牽引力の負荷に伴う軟骨細胞の線維芽細胞への形態変化とa5b1インテグリン分子の発現の関係を解明することを目的として,これを細胞生物学的に検討する.また,軟骨細胞に対する牽引力の負荷に伴いその分化形質としてのII型コラーゲン及びアグリカンの発現が抑制され,かわって線維芽細胞としての形質、フィブロネクチン及びI型あるいはIII型コラーゲンの発現を獲得する,という仮説を検証する.さらに,この過程にインテグリンによる細胞-細胞外基質間の接着が寄与していることを示す.実験材料として胎齢12日のSD系ラットを用い,四肢胚より細胞を顕微鏡下で採取する.続いてこれにtrypsin-collagenaseで処理を施し,細胞を分離した後,DMEM培地を用い培養した.メカニカルストレスの負荷にはFlexer cellを用いた.細胞の分化指標としてのI型,II型,III型コラーゲンや,アグリカン,フィブロネクチンの発現については半定量的RT-PCR法を用いたmRNAの定量によって行った.また,共焦点レーザー顕微鏡と蛍光抗体間接法を用いた免疫染色による形態観察によって,細胞内骨格と細胞・細胞外基質を接着タンパクであるインテグリンが仲介して作り出す接着斑の形成を経時的に観察した.伸展力を負荷した軟骨細胞よりtotal RNAを抽出し,その後逆転写酵素によりcDNAテンプレートを作製し,半定量的PCR法により目的遺伝子の定量実験を行った.結果、伸展力を加えなかった群に比べ,II型コラーゲンおよびアグリカンの遺伝子発現は10〜20%用量依存的に有意に抑制されることが分かった.また,形態観察により,経時的に接着斑の形成が促進されることが示された.これらのことから、機械的伸展力がラット四肢原器由来軟骨細胞の初期分化を抑制すること,これにはintegrinによる細胞-基質問接着が寄与していることが示唆された.

在本研究中，我们将从细胞生物学的角度对此进行研究，目的是阐明由于施加牵引力，软骨细胞向成纤维细胞的形态变化与A5B1整合素分子的表达之间的关系。作为分化特征的II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达被抑制，相反，成纤维细胞特征、纤连蛋白和I型或III型胶原蛋白的表达被抑制。此外，我们还发现整合素诱导的细胞与细胞外基质的粘附有助于这一过程。我们使用12天龄的SD大鼠作为实验材料，并使用肢体胚胎作为实验材料，然后在显微镜下收集细胞。然后用胰蛋白酶-胶原酶处理细胞以分离细胞，然后使用DMEM培养基培养。使用Flexer施加机械应力。通过使用半定量 RT-PCR 定量 mRNA，通过使用激光显微镜的形态学观察和使用间接荧光抗体方法的免疫染色来确定作为细胞分化指标的 I、II、III 型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖和纤连蛋白的表达。随着时间的推移，在细胞内骨架、细胞和细胞外基质之间形成粘着斑，这是由整合素介导的，整合素是粘附蛋白。与负载软骨细胞相比，总拉伸力提取RNA，然后利用逆转录酶制备cDNA模板，利用半定量PCR对目的基因进行定量实验。结果，与未施加拉伸力的组相比，类型的基因II 胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达以剂量依赖性方式显着抑制 10-20%。此外，形态学观察表明，随着时间的推移，粘着斑的形成得到促进。这些结果表明，机械拉伸力抑制了大鼠肢体祖源性软骨细胞的初始分化，这表明整合素介导的细胞-基质粘附对此有贡献。