SOD活性中心の点突然変異を導入したALSマウスモデルの作成に関する研究

SOD活性中心点突变ALS小鼠模型的构建

基本信息

批准号：
11770323
负责人：
青木正志
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis以下ALS)は進行性の難治性神経疾患で、その予後はきわめて不良である。ALS発症者の5-10%は家族性ALSで、通常は常染色体優性遺伝形式をとる。近年、家族性ALSにおいてCu/Zn superoxide dismutase(以下Cu/Zn SOD)遺伝子の変異が報告され、それによる運動ニューロン選択的細胞死の機序の解明が待たれている。本研究はCu/Zn SOD遺伝子異常による運動ニューロンの選択的細胞死の機序を解明するために、研究代表者である青木が既に報告している日本人独自の点突然変異をマウスに導入し、ALSの新しいモデルマウスを作成する。臨床的に非常に急速な経過をとることALS家系での点突然変異(L84V)と極めて緩徐な経過をとるALS家系の突然変異(H46R)を持つ2種類のトランスジェニックマウスを作成し、その表現型の違いを検討することにより、神経細胞死の機序を解明することを目的とする。H46R変異はCu/Zn SOD遺伝子の活性中心に存在している。まずプロモーター領域を含むゲノムCu/Zn SOD遺伝子内にミスマッチプライマー法を用いて、前述の日本人家族性ALS患者における点突然変異の導入を行った。その変異遺伝子をマウス受精卵の前核へ微量注入することによりトランスジェニックマウスの作成を行った。生まれてきたマウスの尾部からDNAを抽出しサザンブロット法により導入遺伝子を確認し、生まれたマウスの各臓器における変異Cu/Zn SOD蛋白の発現をウエスタンブロッド法にて確認した。H46R変異を導入したラインのうち変異Cu/Zn SOD蛋白発現量の高いトランススジェニックマウスのラインでは生後約150日で運動ニューロン病の発症がみられ、経過約30日で死亡にいたることが明らかになった。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性、难治性神经系统疾病，预后极差。 5-10% 的 ALS 患者患有家族性 ALS，通常以常染色体显性遗传方式遗传。最近，有报道称家族性ALS中存在铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）基因突变，运动神经元选择性细胞死亡的机制有待阐明。在这项研究中，为了阐明Cu/Zn SOD基因异常导致的运动神经元选择性细胞死亡的机制，我们将主要研究者Aoki已经报道过的日本独特的点突变引入小鼠体内，以创建一种新的点突变。新的 ALS 小鼠模型。我们创建了两种类型的转基因小鼠，其中一种是具有极快临床病程的 ALS 家族中的点突变（L84V），另一种是具有极慢临床病程的 ALS 家族中的突变（H46R），并研究了它们的表达。通过检查这些类型之间的差异来阐明神经元细胞死亡的机制。 H46R突变位于Cu/Zn SOD基因的活性中心。首先，在上述日本家族性 ALS 患者中，使用错配引物方法将点突变引入基因组 Cu/Zn SOD 基因，包括启动子区域。转基因小鼠是通过将突变基因显微注射到受精小鼠卵的原核中而产生的。从新生小鼠尾部提取DNA，通过Southern印迹证实导入的基因，并通过Western印迹证实新生小鼠各器官中突变型Cu/Zn SOD蛋白的表达。在引入H46R突变的品系中，高表达突变型Cu/Zn SOD蛋白的转基因小鼠品系在出生后约150天出现运动神经元疾病，并在约30天后被发现死亡。