シャペロン分子カルネキシンによるタンパク質品質管理機構と病態的意義の解明

阐明伴侣分子钙连接蛋白的蛋白质质量控​​制机制和病理意义

• 批准号: 11770076
• 负责人: 井原 義人
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770076/
• 关键词: カルネキシン; シャペロン; 糖タンパク質; レクチン

カルネキシンは粗面小胞体(ER)に存在するCa2+結合性の分子シャペロンであり、糖タンパク質のフォールディング中間体の正しい組み立てを促進することから、ERでのタンパク質合成の品質管理にとって非常に重要な役割を果たしている。平成12年度は、カルネキシンについてその基質タンパク質認識機構の解析を進めるため、新たなカルネキシンin vitroフォールディングアッセイ系の作成と解析を行った。具体的には、モノグルコシル化糖鎖(Glc1Man9)をもつJack bean α-mannosidaseと、α-mannosidaseからEndoHで糖鎖を除去した基質を作成して、カルネキシンの認識する基質に用いた。これらα-mannosidaseを6M塩酸グアニジンで変性した後、熱処理でタンパク質の凝集を誘導した。精製した可溶化カルネキシンを添加して、その基質の凝集抑制能を測定(Light scattering)することにより、シャペロン作用を評価した。また、α-mannosidaseの変性と再活性化について酵素活性の測定を行い、in vitroアッセイ系にオリゴ糖やATPを加えることにより、シャペロン作用への影響を検討した。解析の結果、以下のことが明かとなった。1)カルネキシンは糖タンパク質のモノグルコシル化糖鎖を認識するとともに変性したポリペプチド部分をも認識する。2)カルネキシンは基質タンパク質の熱変性を防ぎ、変性タンパク質の再活性化を助けることにより、in vitroでのシャペロン活性を示す。3)カルネキシンの基質タンパク質認識において、糖鎖に対する親和性が最も重要である。4)カルネキシンの基質タンパク質認識機構において、ATPはカルネキシンのシャペロン機能を促進する。5)カルネキシンの基質タンパク質認識機構において、糖鎖結合部位への糖鎖の結合はカルネキシンのペプチド結合能を抑制する。

Calnexin 是存在于粗面内质网 (ER) 中的 Ca2+ 结合分子伴侣，在 ER 蛋白质合成的质量控制中发挥着非常重要的作用，因为它促进糖蛋白折叠中间体的正确组装。 2000年，我们创建并分析了一种新的钙联蛋白体外折叠测定系统，以进一步分析钙联蛋白底物蛋白的识别机制。具体来说，我们通过用 EndoH 从 α-甘露糖苷酶中去除糖链，创建了具有单葡萄糖基化糖链 (Glc1Man9) 和底物的刀豆 α-甘露糖苷酶，并将其用作钙联蛋白识别的底物。用6M盐酸胍使这些α-甘露糖苷酶变性后，通过热处理诱导蛋白质聚集。通过添加纯化的溶解的钙联蛋白并测量其抑制底物聚集的能力（光散射）来评估伴侣效应。我们还测量了 α-甘露糖苷酶变性和再激活的酶活性，并通过在体外测定系统中添加寡糖和 ATP 来研究对分子伴侣作用的影响。分析的结果，以下内容变得清晰。 1) Calnexin 识别糖蛋白的单葡萄糖基化糖链，也识别变性的多肽部分。 2) Calnexin 通过防止底物蛋白的热变性并协助变性蛋白的重新激活而在体外表现出伴侣活性。 3）在calnexin对底物蛋白的识别中，对糖链的亲和力是最重要的。 4）在钙联蛋白的底物蛋白识别机制中，ATP促进钙联蛋白的伴侣功能。 5)在钙联蛋白的底物蛋白识别机制中，糖链与糖链结合位点的结合抑制了钙联蛋白的肽结合能力。

项目成果

Saito Y. et al.: "Calreticulin functions in vitro as a molecular chaperone for both glycosylated and unglycosylated proteins."EMBO J.. 18. 6718-6729 (1999)

Saito Y. 等人：“钙网蛋白在体外充当糖基化和非糖基化蛋白质的分子伴侣。”EMBO J.. 18. 6718-6729 (1999)

Saito Y.et al.: "Calreticulin functions in vitro as a molecular chaperone for both glycosylated and unglycosylated proteins"ENBO J.. 18. 6718-6729 (1999)

Saito Y.等人：“钙网蛋白在体外作为糖基化和非糖基化蛋白质的分子伴侣起作用”ENBO J.. 18. 6718-6729 (1999)

Kang R. et al.: "Cell cycle-dependent regulation of N-acetylglucosaminyltransferase-III in a human colon cancer cell line, colo201."Arch.Biochem.Biophys.. 374. 52-58 (2000)

Kang R.等人：“人结肠癌细胞系colo201中N-乙酰葡糖胺基转移酶-III的细胞周期依赖性调节。”Arch.Biochem.Biophys.. 374. 52-58 (2000)

Yamamoto H. et al.: "Beta1,6-N-acetylglucosamine-bearing N-glycans in human gliomas : Implications for a role in regulating invasivity."Cancer Res.. 60. 134-142 (2000)

Yamamoto H. 等人：“人类神经胶质瘤中含有 Beta1,6-N-乙酰葡糖胺的 N-聚糖：对调节侵袭性的作用的影响。”Cancer Res.. 60. 134-142 (2000)