ホウ素欠乏ストレスで誘導される遺伝子の単離と機能解析

缺硼胁迫诱导基因的分离及功能分析

基本信息

批准号：
11760046
负责人：
小林優
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

高等植物のホウ素欠乏による細胞死の機構を解明するため、ホウ素欠乏で発現が誘導される遺伝子の検索を行った。実験にはタバコ培養細胞BY-2を用いた。細胞をホウ素を含まない培地で洗浄後、同培地(-B培地)あるいは通常培地(+B培地、1ppmホウ素を含む)に移植し、細胞の生死を二酢酸フルオレセイン-ヨウ化プロピジウム二重染色で観察した。その結果、-B培地では処理後24-36時間で死細胞の割合が増加し始めることが分かった。また死細胞ではヨウ化プロピジウムは核および原形質膜上に集積していると推定された。典型的なプログラム細胞死を誘導すると考えられている過酸化水素、Triton X-100処理では核のみが強く染色され、ホウ素欠乏による細胞死の場合とは一致しなかった。次に、ホウ素欠乏によって発現が誘導される遺伝子を検索した。上記のように欠除処理した細胞と対照細胞について、まずディファレンシャルディスプレイ法で比較した。100通りのプライマーセットを用い欠除処理時間1、3、6および48時間で検討したが、発現量に差のある遺伝子を再現性良く検出することはできなかった。またディファレンシャルスクリーニング法、cDNAサブトラクション法も試みたが明確な結果は得られなかった。そこでタバコ培養細胞BY-2の各種ストレス誘導性遺伝子や細胞壁関連蛋白質遺伝子をピックアップし、それらがホウ素欠乏で誘導されるかRT-PCRで検討した。その結果ACC oxidaseおよびa-expansin遺伝子の発現量が、-B48時間の細胞で対照より多いことを見いだした。その生理的な意義は現時点では不明である。また発現のタイミングから考えるとホウ素欠乏の直接的な結果でなく二次的な影響の可能性が高いが、これらをプローブとするノザン解析で障害の発生時期を絞り込めると考える。

为了阐明高等植物缺硼导致细胞死亡的机制，我们寻找缺硼诱导表达的基因。实验中使用烟草培养细胞BY-2。用无硼培养基洗涤细胞后，转移至相同培养基（-B培养基）或正常培养基（+B培养基，含1ppm硼），荧光素二乙酸-碘化丙啶双染法测定细胞活力观察到。结果显示，在-B培养基中，死亡细胞的百分比在处理后24-36小时开始增加。此外，在死细胞中，估计碘化丙啶积聚在细胞核和质膜上。过氧化氢和 Triton接下来，我们寻找缺硼诱导表达的基因。首先使用差异显示法对如上所述进行缺失处理的细胞和对照细胞进行比较。尽管使用了100个不同的引物组并且研究了1、3、6和48小时的缺失处理时间，但不能以良好的重现性检测具有不同表达水平的基因。我们也尝试过差异筛选和cDNA消减方法，但没有得到明确的结果。因此，我们在培养的烟草BY-2细胞中选择了多种胁迫诱导基因和细胞壁相关蛋白基因，并利用RT-PCR检测它们是否是缺硼诱导的。结果，我们发现 -B48 小时细胞中 ACC 氧化酶和 a-expansin 基因的表达水平高于对照组。其生理意义目前尚不清楚。此外，考虑到表达的时间，这可能是继发效应，而不是缺硼的直接结果，但我们相信使用这些作为探针的 Northern 分析将缩小该疾病发病的时间范围。