遺伝子学的手法を用いたUV殺菌水処理に伴う光回復現象の解明に関する研究

利用遗传方法阐明与紫外线杀菌水处理相关的光恢复现象的研究

基本信息

批准号：
11750489
负责人：
大瀧雅寛
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Ochanomizu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

UV照射後の二量体検出法の前段階として大腸菌ファージであるDNAファージT4を対象微生物とし、DNA抽出方法の検討を行った.抽出方法として3つの方法を検討した。(1)抽出キット(QIAGEN Lambda System)による方法、(2)UF膜による遠心濃縮,膜ろ過後,90℃の熱によるタンパク破砕による方法、(3)UF膜による遠心濃縮液に(1)で使用した抽出キットを適用する方法、以上の方法の後、アガロースゲルによる電気泳動で核酸が抽出できているかどうを確認した。結果として(1)で抽出したサンプルでは,アガロースゲル電気泳動でバンドが観察されたものの非常に薄かった。この原因は元々50kbのλファージよりDNAを抽出するためのものであり,T4ファージは166kbでλファージと比べて長いため,カラムからの溶出が不十分であったためと考えられる。改善方法として、溶出液の溶出力を上げるために溶出液を温めることが考えられた。(2)で抽出したサンプルでは,アガロースゲル電気泳動でT4ファージのDNAによるバンドが観察されたが,T4ファージよりも大きいサイズでもバンドが観察された。このバンドは宿主菌の遺伝子の一部がろ過膜で除去しきれなかったためと考えられる。従ってこの方法では宿主菌の遺伝子の除去方法に関する改良が必要である。改善方法としては、熱破砕を行う前にDNaseを加え,宿主菌によるDNAを壊してから熱破砕を行えばよいと考えられる。(3)で抽出したサンプルはアガロース電気泳動でバンドが観察されなかった。これは、PEGによる沈殿とSDSによる外被分解の段階で、このキットにおける適用量がT4のDNAに利用できる限界を超えてしまったためと考えられる。また濃縮により全量が少ないため、カラムに吸着させた後の回収率が悪いこと、および(1)と同じ原因が考えられた。以上の検討によりDNA抽出法の確立を行った。

作为UV照射后二聚体检测方法的预备步骤，使用DNA噬菌体T4(其是大肠杆菌噬菌体)作为目标微生物研究了DNA提取方法。 (1) 使用提取试剂盒（QIAGEN Lambda System）的方法，(2) 使用 UF 膜离心浓缩的方法，膜过滤后在 90°C 下加热进行蛋白质破碎，(3) 使用 UF 膜离心浓缩的方法（ 1).应用所用提取试剂盒和上述方法后，通过琼脂糖凝胶电泳确认是否可以提取核酸。结果，在(1)中提取的样品中，虽然在琼脂糖凝胶电泳中观察到条带，但条带非常微弱。其原因被认为是DNA最初是从50kb的λ噬菌体中提取的，而T4噬菌体为166kb，比λ噬菌体长，因此从柱上的洗脱不充分。作为一种改进方法，考虑对洗脱液进行加温以提高洗脱液的洗脱能力。 (2)中提取的样品中，在琼脂糖凝胶电泳中观察到由T4噬菌体DNA产生的条带，但即使是比T4噬菌体大的条带也观察到。这条带被认为是由于宿主细菌的部分基因没有被过滤膜完全去除。因此，该方法需要对去除宿主细菌基因的方法进行改进。一种可能的改进方法是在热破碎前添加DNA酶，破坏宿主细菌引起的DNA，然后进行热破碎。 (3)中提取的样品经琼脂糖电泳未观察到条带。这被认为是因为在用 PEG 沉淀和用 SDS 分解包膜的步骤中，该试剂盒中使用的量超过了 T4 DNA 的可用限度。另外，由于浓缩而总量少，因此柱上吸附后的回收率差，考虑与(1)相同的原因。基于以上研究，我们建立了DNA提取方法。