イネ酸素ストレス防御遺伝子の発現調節におけるレドックス制御

氧化还原调控调控水稻氧胁迫防御基因的表达

基本信息

批准号：
11740448
负责人：
森田重人
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

イネにおいて酸素ストレスの防御に関与している3つの酵素、細胞質型スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)、細胞質型チオレドキシン、グルタレドキシンのそれぞれの遺伝子の5′-上流域には、非常に相同性の高い28bpの領域が存在している。本研究では、この共通配列が3つの遺伝子の発現調節に関与している可能性を検討している。前年度までに、細胞質型SOD遺伝子のプロモーター領域のうち、この28bpの配列がスーパーオキシドに応答するシス-エレメントであることを明らかにしている。今年度はさらにこの配列のシス-エレメントとしての特異性を検討した。この配列に変異を導入した配列をCaMV35Sプロモーターとルシフェラーゼの融合遺伝子の上流に連結したレポーターコンストラクトを作製した。これをイネ培養細胞に導入してトランジェントアッセイを行った。28bpの配列には、パリンドローム構造をもつ19bpの領域が存在している。パリンドローム領域に変異を導入した場合には、スーパーオキシドによるルシフェラーゼ活性の誘導は見られなかった。このことから、パリンドローム構造をもつ19bpの配列がスーパーオキシドに対する応答に関与することが示された。また上記のレポーターコンストラクトには、遺伝子発現を上昇させるためにイネ細胞質型SOD遺伝子の5′-non coding intronを組み込んでいる。このintronの効果を定量的に測定したところ、CaMV35Sプロモーターの下流に接続した場合、遺伝子の発現を最大で28.5倍まで上昇させることが明らかとなった。また上記シスーエレメントに結合する転写因子の単離を行うために、yeast one hybrid screeningによるDNA結合タンパク質のcDNAクローニングを試みたが、質のよいライブラリの作製に難航しクローンの単離に至っていない。

水稻中参与氧胁迫防御的三种酶——胞质超氧化物歧化酶（SOD）、胞质硫氧还蛋白和谷氧还蛋白的5'上游区域含有高度同源的28bp基因。在这项研究中，我们正在研究这个共同序列参与调节这三个基因表达的可能性。去年，我们发现细胞质 SOD 基因启动子区的这个 28 bp 序列是一个对超氧化物做出反应的顺式元件。今年，我们进一步研究了该序列作为顺式元件的特异性。创建了报告构建体，其中该序列的突变序列连接到CaMV35S启动子和荧光素酶的融合基因的上游。将其引入培养的水稻细胞中并进行瞬时测定。 28bp 序列包括具有回文结构的 19bp 区域。当突变被引入回文区域时，没有观察到超氧化物诱导荧光素酶活性。这表明 19 bp 回文序列参与了对超氧化物的反应。上述报告构建体还整合了水稻细胞质 SOD 基因的 5'-非编码内含子，以增加基因表达。对该内含子作用的定量测量表明，当连接到 CaMV35S 启动子下游时，基因表达量增加了 28.5 倍。此外，为了分离与上述顺式元件结合的转录因子，我们尝试通过酵母一杂交筛选对DNA结合蛋白进行cDNA克隆，但很难制备高质量的文库，并且没有分离出克隆。。