組換え蛋白質複合体の精製と機能解析

重组蛋白复合物的纯化和功能分析

基本信息

批准号：
10780428
负责人：
太田力
金额：
$ 1.47万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

1. 研究の目的:真核生物の遺伝的組換えは、減数分裂期組換え、DNA傷害の修復、DNA複製時エラーの除去、遺伝子発現制御など多方面で機能して、生物の多様性と子孫の安定な保持において重要な役割を担っている。特に、組換えは減数分裂期で高頻度で起こり、出芽酵母では、これまで数十個の遺伝子が同定され、3つのグループに分けられている。即ち、組換えを制御するグループ(I)、組換えの開始である二本鎖DNA切断の導入に関与するもの(II)、相同DNAの検索、対合と交叉に働くもの(III)である。これら3つのグループの遺伝子産物は蛋白質複合体を形成することがTwo-Hybrid法、共同的免疫沈降法及び遺伝的解析から示唆されている。本研究では組換えを行う蛋白質複合体を分離、精製し、その活性解析を目的とした。2. 研究成果:酵母の遺伝学的研究から相同組換えの最初の反応である二本鎖DNAの切断に関与すると考えられているMRE11遺伝子のアミノ末端にGST-tagを付けたものを大腸菌で発現させGSTに対するカラム、Niカラム、dsDNAカラム、MonoSカラムを用いてMRE11蛋白質を精製することに成功した。このMRE11蛋白質は一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの切断活性を持つことが分かった。また、酵母から精製したMRE11蛋白質の活性を調べた結果、大腸菌を用いた組換え体MRE11蛋白質と同様の活性が検出された。

1。研究的目的：真核生物的遗传重组在各种领域都起作用，例如重组，DNA损伤的修复，DNA重复的去除和基因表达控制，并且在生物的多样性中起着重要作用。稳定的后代维护。特别是，重组经常发生在任务时期，并且迄今为止的数十个基因已经确定了细菌酵母，并且已分为三组。换句话说，一个控制重组的组（i），涉及引入双链DNA切割的组，这是重组的开始（II），搜索同源DNA和相交（III）。通过两种杂交方法，关节免疫沉淀法和遗传分析提出，这三组的基因产物形成了蛋白质复合物。在这项研究中，重组的蛋白质复合物被分离，纯化，目的是分析活性。 2。研究结果：带有GST标记的大肠杆菌附着于MRE11基因的氨基端，认为这与切割双链DNA有关，这是同源重组从遗传研究中的第一个反应酵母MRE11蛋白成功地使用了GST的色谱柱，Ni柱，DsDNA柱和Monos柱。事实证明，该MRE11蛋白具有单个链DNA和双链DNA的切割活性。此外，由于检查了从酵母中纯化的MRE11蛋白的活性，因此检测到与使用大肠杆菌的重组MRE11蛋白相同的活性。