ムスカリン性アセチルコリン受容体の2次元結晶化

毒蕈碱乙酰胆碱受体的二维结晶

基本信息

批准号：
10780400
负责人：
小川治夫
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780400/
关键词：
アセチルコリン受容体二次元結晶界面活性剤 SF9 バキュロウィルス

项目摘要

SF9/バキュウロウィルス系で発現させたムスカリン性アセチルコリン性受容体M_2サブタイプの二次元結晶化を試みている。昨年度の研究で、界面活性剤にアルキルマルトシドを用い、精製を行うことで受容体をリポソームに効率よく組み込めることが分かった。だが、受容体をアルキルマルトシドで直接可溶化した場合には、その安定性に問題がある場合が多かった。そこで、再び精製法の検討を行うことにした。可溶化の際にアンタゴニストであるQuinuclidinyl benzilate(QNB)を予め結合させておくと数週間にわたり受容体が安定であることが分かった。だが、この条件だと受容体にアンタゴニストが結合しているため、精製に最も効果を発揮するリガンドカラム(ABTアガロース)を用いることができない。検討の結果、以下の条件が最適であることが分かった。デシルマルトシドで可溶化したQNB-受容体複合体を(1)S.P.-セファロース(2)Co^<2+>キレーティング・セファロース(3)リソースSの順に精製し可溶化時の約60%の回収率でSDS-PAGE上で精製度がほぼ均一なサンプルを得ることができた。また、脂質への再構成の際、脂質:蛋白の重量比を2次元結晶化に理想的な値である1:1で行ったところ、電子顕微鏡で、直径約0.4μmのプロテオリポソームを観察することができた。現在はこの新しい精製法で得られた受容体を用い、2次元結晶化へ向けて、溶液等の条件検討を行っている段階である。

我们正在尝试对 SF9/杆状病毒系统中表达的毒蕈碱乙酰胆碱能受体 M_2 亚型进行二维结晶。去年的研究表明，通过使用烷基麦芽糖苷作为表面活性剂并进行纯化，可以将受体有效地整合到脂质体中。然而，当受体直接用烷基麦芽糖苷增溶时，其稳定性常常存在问题。因此，我们决定重新考虑纯化方法。如果在溶解过程中预先结合拮抗剂苯甲酸奎宁环酯 (QNB)，则发现该受体可稳定数周。然而，在这些条件下，拮抗剂与受体结合，因此不能使用对纯化最有效的配体柱（ABT琼脂糖）。研究结果表明，以下条件是最佳的。将用癸基麦芽糖苷溶解的QNB-受体复合物按照(1)S.P.-Sepharose(2)Co^2+螯合Sepharose(3)资源S的顺序进行纯化。溶解的约60％可以获得样品在 SDS-PAGE 上具有基本一致的回收率和纯度。此外，当以二维结晶的理想值脂质：蛋白质重量比1:1进行脂质重构时，使用电子显微镜观察到直径约0.4μm的蛋白脂质体。能够做到这一点。我们目前正处于研究使用通过这种新纯化方法获得的受体进行二维结晶的溶液条件和其他条件的阶段。