ヒトマウスSim2遺伝子の発現調節機構とダウン症精神遅滞

人鼠Sim2基因表达与唐氏综合征智力低下的调控机制

• 批准号: 10771337
• 负责人: 八巻 明子
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyorin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771337/
• 关键词: ダウン症候群; Sim2遺伝子; 転写開始点; プロモーター領域; 転写因子; cis-エレメント; ゲルシフトアッセイ; GFP; 欠失変異体; ルシフェラーゼ活性

(1)ヒト21番染色体長腕q22.2上に座位するSIM2遺伝子の転写機構を明らかにするために、ルシフェラーゼ発現ベクター(pGL3-Basic)へ組み込んだSIM2遺伝子転写調節領域の解析から、転写開始点上流-1385〜1325の60-bpの領域に強いルシフェラーゼが見られた。この60-bpの領域に存在する既知のcis-エレメントをコンピュータ検索(TFSEARCH)し、E2F、c-myb、E47の3種の転写因子結合部位が予測された。それぞれ因子の結合部位のコンセンサス配列から1塩基のみを変異させ、同様にプロモーター活性を測定したところ、E2F変異体では野生型に比べ活性が1.5倍増加した。c-myb結合領域がSIM2遺伝子の転写機構に何からの影響をもたらすことが示唆された。また、60-bpの領域内から作製した8種類の配列(c-mybW1〜W5、c-mybM、E47W、E47M)を用いてゲルシフトアッセイを行った。c-mybコンセンサス配列を^<32>P放射性プローブ(c-mybW1)にし、8種類を非放射性プローブとして競合実験を行ったところ、c-mybW1とc-mybコンセンサス配列からわずか2-bp上流にずらし下流5-bp短くしたプローブ(c-mybW4)においてシフトバンドの消失が起こった。8種類を全て放射性プローブにしてゲルシフトアッセイを行ったところ、競合実験と同じくc-mybW1とc-mybW4に特異的なシフトバンドが検出された。今後はシフトバンドからSIM2遺伝子特異的な転写制御因子が何かを同定する(2)ヒトSIM2蛋白質の各ドメインをグリーン蛍光蛋白質(GFP)発現ベクター(pEGFP-N1)に組み込み、ヒトSIM2蛋白質との融合蛋白をグリオブラストーマ由来のT98G細胞内に発現させ蛍光顕微鏡を用いて細胞内発現を観察した。結果、ヒトSIM2蛋白質全長を発現させると核内に発現が見られるが、N末端のbHLHドメインのみでは細胞全体に、bHLH-PASドメインのみでは細胞質内に局在し、中央付近のHSTドメインのみでもbHLH-PASドメインのみとは異なる発現パターンであるが細胞質内に局在することが分かった。今後は、C末端における発現パターンの検討や、詳細な細胞質内局在について検討する。

(1)为了阐明位于人类21号染色体长臂q22.2上的SIM2基因的转录机制，我们分析了SIM2基因的转录调控区，将其插入荧光素酶表达载体(pGL3-Basic ），并在该点上游-1385至-1325的60bp区域中观察到强荧光素酶。对这个 60 bp 区域中已知顺式元件的计算机搜索 (TFSEARCH) 预测了三个转录因子的结合位点：E2F、c-myb 和 E47。当每个因子结合位点的共有序列仅突变一个碱基并类似地测量启动子活性时，与野生型相比，E2F突变体的活性增加了1.5倍。提示c-myb结合区对SIM2基因的转录机制有一定影响。另外，使用从60bp区域内制备的八种序列（c-mybW1至W5、c-mybM、E47W和E47M）进行凝胶位移测定。当我们使用c-myb共有序列作为^<32>P放射性探针(c-mybW1)和八种非放射性探针进行竞争实验时，我们发现c-mybW1和c-myb共有序列是探针 (c-mybW4) 中仅出现 2-bp 上游的移动条带消失，下游缩短了 5-bp。当使用所有八种类型作为放射性探针进行凝胶位移测定时，检测到 c-mybW1 和 c-mybW4 特异性的位移带，如竞争实验中一样。未来，我们将从移位带中鉴定出SIM2基因特异性转录调节因子（2）我们将把人SIM2蛋白的每个结构域整合到绿色荧光蛋白（GFP）表达载体（pEGFP-N1）中并与人相互作用。 SIM2蛋白在胶质母细胞瘤来源的T98G细胞中表达，并使用荧光显微镜观察细胞内表达。结果，当全长人SIM2蛋白表达时，它在细胞核中表达，但仅N末端bHLH结构域定位于整个细胞，仅bHLH-PAS结构域定位于细胞质，并且中心附近的HST结构域单独定位于细胞质中，尽管表达模式与单独的bHLH-PAS结构域的表达模式不同，但发现它定位于细胞质中。将来，我们将检查 C 末端的表达模式和详细的细胞质定位。