血液網膜関門新規実験系の開発と輸送機能解析

新型血视网膜屏障实验系统的开发及转运功能分析

基本信息

批准号：
10771316
负责人：
細谷健一
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771316/
关键词：
血液網膜関門眼条件的不死化細胞株 P-糖蛋白質乳酸輸送モノカルボン酸輸送 MCT1 MCT2 温度感受性SV40T抗原遺伝子導入トランスジェニックラット網膜 T-抗原不死化細胞クローン GLUT-1 グルコース輸送

项目摘要

温度感受性SV40T抗原遺伝子導入トランスジェニックラットから樹立した条件的不死化網膜毛細血管内皮細胞(TR-iBRB)はRT-PCR法により血管内皮細胞のマーカーであるvon Willebrand factor mRNAの発現が示された。さらに、acetylated LDLの取り込みによりscavenger receptorの発現が示唆された。Western blot法によりP-糖蛋白質が発現していること、及びRT-PCR法によりそのmRANであるmdr1a,mdr1b,mdr2が発現していることが示された。TR-iBRBにおける[^<14>C]L-lactateの取り込みはpH 依存性、温度依存性、及び濃度依存性(Km=1.7mM)を示した。この取り込みは、エネルギー代謝阻害剤であるsodium azide、2,4-dinitrophenolにより有意に阻害された。さらにH^+/モノカルボン酸共輸送系を阻害するα-cyano-4-hydroxycinnamic acid及びプロトノフォアであるFCCPにより有意に阻害された。一方、DIDS、NA^+非存在下では阻害されなかった。種々の芳香族及び脂肪族のモノカルボン酸において[^<14>C]L-lactateの取り込みは阻害されたことにより、H^+濃度勾配を駆動力とするモノカルボン酸輸送系が機能していることが示唆され、RT-PCR法によりmonocarboxylate transporter1(MCT1)及びMCT2の発現が示された。さらに、NHE1mRNAの発現が示され、amilorideにより[^<14>C]L-lactateの取り込みは阻害された。以上の結果から、TR-iBRB2はH^+/L-lactate共輸送系が機能していることが明らかとなり、NHEがプロトン濃度勾配を形成していることが示唆された。

条件永生化视网膜毛细血管内皮细胞（TR-iBRB）是从携带温度敏感的SV40T抗原基因的转基因大鼠中建立的，通过RT-PCR显示其表达血管性血友病因子mRNA，这是血管内皮细胞的标志物。此外，乙酰化低密度脂蛋白的摄取表明清道夫受体的表达。 Western blotting显示P-糖蛋白表达，RT-PCR显示其mRANs mdr1a、mdr1b和mdr2表达。 TR-iBRB中的[^ 14 C]L-乳酸吸收是pH依赖性、温度依赖性和浓度依赖性的(Km＝1.7mM)。这种吸收被能量代谢抑制剂叠氮化钠和 2,4-二硝基苯酚显着抑制。此外，它受到α-氰基-4-羟基肉桂酸和FCCP（一种质子载体）的显着抑制，α-氰基-4-羟基肉桂酸可抑制H^+/单羧酸共转运系统。另一方面，在没有 DIDS 和 NA^+ 的情况下，它不会受到抑制。 [^ 14 C]L-乳酸的摄取在各种芳香族和脂肪族单羧酸中被抑制，表明由H^+浓度梯度驱动的单羧酸转运系统发挥单羧酸转运蛋白1(MCT1)和的表达作用。 MCT2 通过 RT-PCR 得到证实。此外，显示NHE1 mRNA表达，并且[^ 14 C]L-乳酸摄取被阿米洛利抑制。上述结果揭示了TR-iBRB2中H^+/L-乳酸共转运系统发挥作用，表明NHE形成质子浓度梯度。