生体蛍光プローブを用いた副鼻腔粘膜上皮の薬剤反応性に関する分子生物学的解析

使用生物荧光探针对鼻窦粘膜上皮药物反应性进行分子生物学分析

• 批准号: 10770885
• 负责人: 竹野 幸夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10770885/
• 关键词: ヒスタミン; 線毛細胞; 共焦点レーザ顕微鏡; 副鼻腔粘膜; 一酸化窒素; 線毛打頻度; DAF-2DA; FM 4-64; 共焦点レーザー顕微鏡

慢性副鼻腔炎の病態の遷延化と重症化の原因として、局所粘膜に持続的に動員される好中球・単核球による組織障害が重要視されている。これらの細胞はサイトカイン・ネットワークを介して、上皮細胞の増殖・分化能力の調節並びに、ケミカルメディエータに対する上皮細胞の反応性にも影響を及ぼしていることが示唆されている。今年度の研究では昨年度に引き続き、styrylpyridinium系色素などの各種の蛍光プローブの細胞導入技術を活用し、ヒト培養副鼻腔上皮細胞を標識し、線毛細胞における受容体介在型endocytosisの過程とゴルジ装置・分泌顆粒などの細胞内小器官の動態の解析を行った。すなわち代表的なケミカルメディエータであるヒスタミン刺激反応については、1)10-3〜10-5Mの刺激に対して約20%の線毛打頻度(CBF)増加が認められ、2)この反応はH1受容体を介していること、3)線毛細胞のapical surfaceにおける活発なendocytosisの可視化、を解明した。さらに本年度は、代表的な炎症性サイトカインであるTNF-αが線毛細胞に及ぼす影響と、近年着目されている一酸化窒素(NO)の役割について検討した。NOの可視化には新たに開発された蛍光プローブであるDAF-2 DAを用い、培養細胞よりのNO産生をリアルタイムに可視化・定量化を行った。この研究では、1)TNF-αの作用はその刺激濃度によって、CBF亢進(低濃度)とCBF抑制(高濃度)と相反する面があること、2)培養線毛細胞よりのNO産生はTNF-α刺激により著明に増大すること、3)線毛細胞における異なったNO産生酵素(NOS)の誘導が可能であること、が明らかになった。これらの結果は、NOが有する鼻副鼻腔の生理的恒常性の維持と、炎症活動維持のメディエータという多面性を示しているものと思われた。

中性粒细胞和单核细胞不断募集到局部粘膜引起的组织损伤被认为是慢性鼻窦炎病理延长和加重的重要原因。有人提出，这些细胞通过细胞因子网络影响上皮细胞的增殖和分化能力的调节以及上皮细胞对化学介质的反应性。延续去年的研究，今年的研究将利用苯乙烯基吡啶基染料等各种荧光探针的细胞导入技术来标记培养的人鼻窦上皮细胞，并研究纤毛细胞和高尔基体中受体介导的内吞作用的过程。我们分析了细胞内细胞器（例如分泌颗粒）的动力学。换句话说，关于组胺刺激反应（一种典型的化学介质），1）在 10-3 至 10-5M 的刺激下，观察到纤毛跳动频率（CBF）增加约 20%，2）反应是 3) 纤毛细胞顶端表面活跃内吞作用的可视化。此外，今年我们还研究了典型炎症细胞因子TNF-α对纤毛细胞的影响以及近年来引起关注的一氧化氮（NO）的作用。为了可视化 NO，我们使用了新开发的荧光探针 DAF-2 DA，实时可视化和量化培养细胞的 NO 产生。在本研究中，我们发现：1) TNF-α 的作用与 CBF 增强（低浓度）和 CBF 抑制（高浓度）相矛盾，具体取决于其刺激浓度，2）培养的纤毛细胞的 NO 产生受到 TNF 的影响-α。据揭示，-α刺激显着增加NO产生，并且3)可以在纤毛细胞中诱导不同的NO产生酶(NOS)。这些结果似乎表明 NO 作为维持鼻窦生理稳态和维持炎症活动的介质的多方面性质。

项目成果

竹野 幸夫 他: "鼻副鼻腔粘膜上皮のヒスタミンに対する反応性-蛍光プローブの取り込みと線毛打頻度による検討-"耳鼻咽喉科免疫アレルギー. 16. 66-67 (1998)

Yukio Takeno 等人：“鼻窦粘膜上皮对组胺的反应性 - 通过荧光探针摄取和菌毛频率进行调查 -” 耳鼻喉科免疫学和过敏症。 16. 66-67 (1998)

竹野 幸夫 他: "FM4-64TMを用いた培養篩骨洞粘膜上皮細胞における細胞膜リサイクリング過程の観察"日本鼻科学会会誌. 37. 110-115 (1998)

Yukio Takeno等人：“使用FM4-64TM观察培养的筛窦粘膜上皮细胞的细胞膜回收过程”日本鼻学会杂志37. 110-115 (1998)。

上田直之、竹野幸夫 他: "TNF-αとIFN-αの副鼻腔線毛運動への影響-塩酸アンブロキソールの併用効果"耳鼻臨床. 93. 167-173 (2000)

Naoyuki Ueda、Yukio Takeno 等人：“TNF-α 和 IFN-α 对鼻窦纤毛运动的影响 - 盐酸氨溴索的联合作用”Otorhinolaryngology 93. 167-173 (2000)。

竹野 幸夫 他: "副鼻腔線毛上皮におけるヒスタミン刺激に対する線毛打頻度の抗進と蛍光プローブによる細胞膜標識の増強"耳鼻臨床. 補102. 1-8 (1999)

Yukio Takeno 等人：“鼻窦睫状上皮中组胺刺激导致睫状中风的频率降低，荧光探针增强细胞膜标记” 耳鼻喉科临床增刊 102. 1-8 (1999)

Takeno S, et al.: "Histamine augments ciliary beat frequency and cell membrane recycling processes in ciultured human nasal ethmoidal cells."Rhinology. Suppl 15. 126-127 (1999)

Takeno S 等人：“组胺增强了培养的人鼻筛细胞中的纤毛跳动频率和细胞膜回收过程。”鼻学。