アルコールに対する生体反応タンパク質の解析と代謝過程の関係

酒精生物反应蛋白与代谢过程关系的分析

基本信息

批准号：
09770299
负责人：
松本博志
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

エタノールの急性摂取時の生体反応タンパクの解析にあたり、転写制御因子に着目した。Wistar系雄ラットを用いて灌流実験を行った。実験後、肝臓を細胞分画した。核画分についてはゲルシフト法にて転写制御因子NF-κBおよびAP-1のDNA結合活性を検出した。細胞可容画分についてはwestern blottingを行って、IκBαを検出した。50mM EtOH灌流群についてはNF-κBのDNA結合活性が潅流20分で最大に達した後減少するのに対して、100mM EtOH灌流群では、経時的に上昇した。CYP2El代謝阻害剤を付加すると50mM EtOH灌流20分でのDNA結合活性は認められなかったが、60分後には活性はかなり上昇した。したがって、潅流20分におけるNF-κB活性の上昇にはCYP2Elを介する代謝系が関与していることが示された。しかしながら、阻害剤付加60分後では活性化したことから、EtOH潅流20分と60分の活性化に異なる機序の存在が示唆された。Western blottingによる検討では、IκBαはEtOH潅流20分で検出されないのに対して、60分後では再び検出されることから、異なるIκBが関与していることが明らかになった。このことは、p65の抗体を適用したsuper shift assayにおいても20分では抗p65抗体による著明なsupershiftが認められるのに対して、60分では認められなかったことからも裏付けられる。MAPKKKの一つであるMEKKlはIκBβのみを活性化することが知られている。そこで、MAPK cascadeによって活性化されるAP-1のDNA結合活性を調べたところ、EtOH濯流群で違いはなかった。したがって、少なくともMEKK1はMAPK cascadeの活性化を伴なう形ではEtOH灌流によるNF-κB活性化の2相性に関与しない可能性が高い。

在分析急性乙醇摄入期间的生物反应蛋白时，我们重点关注转录调节因子。使用 Wistar 雄性大鼠进行灌注实验。实验结束后，对肝脏进行细胞分级分离。对于核级分，使用凝胶迁移法检测转录调节因子NF-κB和AP-1的DNA结合活性。对细胞可用部分进行蛋白质印迹以检测 IκBα。在50mM EtOH灌注组中，NF-κB的DNA结合活性在灌注20分钟时达到最大值，然后下降，而在100mM EtOH灌注组中，它随着时间的推移而增加。当添加CYP2E1代谢抑制剂时，50mM EtOH灌注20分钟后未观察到DNA结合活性，但60分钟后活性显着增加。因此，表明CYP2E1介导的代谢系统参与灌注20分钟时NF-κB活性的增加。然而，在添加抑制剂后 60 分钟发生激活，表明在 EtOH 灌注 20 分钟和 60 分钟时存在不同的激活机制。 Western blotting显示，EtOH灌注20分钟后未检测到IκBα，但60分钟后再次检测到IκBα，表明涉及不同的IκB。这也得到以下事实的支持：在使用p65抗体的超级转变测定中，在20分钟时观察到由抗p65抗体引起的显着超级转变，但在60分钟时没有观察到。 MEKK1，MAPKKK之一，已知仅激活IκBβ。因此，当我们研究由 MAPK 级联激活的 AP-1 的 DNA 结合活性时，EtOH 冲洗组没有差异。因此，MEKK1 很可能不参与 EtOH 灌注诱导的双相 NF-κB 激活，至少以涉及 MAPK 级联激活的方式参与。