線虫C．elegansのCu＾＜2＋＞ポンプATPaseの構造と機能に関する研究

线虫 C.

基本信息

批准号：
09760302
负责人：
三本木至宏
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760302/
关键词：
線虫重金属イオントランスポーター

项目摘要

(1)C.elegans Cu^<2+>ポンプATPaseの生化学的な機能解析のため、酵母を用いて本cDNAの発現系を確立した。PCRの手法を用いて本酵素にアミノ酸置換を施し酵母で発現させ、機能に必須であるアミノ酸配列(Cys-Pro-Cys、Asp-Lys-Thr-Gly)を同定した。さらに、ヒトのCu^<2+>ポンプATPase(Wilson病原因遺伝子)についても同様の系で機能を解析した。(2)Cu^<2+>ポンプATPaseのC.elegansにおける役割を調べるため、Cu^<2+>ポンプATPase遺伝子にトランスポゾンが挿入された株をスクリーニングし、Cu^<2+>ポンプATPase欠損変異株を作製した。現在、得られた欠損変異体に、発生の異常、あるいは重金属イオンの代謝異常などが起こらないかどうかを明らかにしている。また同時に、野生体の生育が重金属イオンの存在で影響されるかどうか調べたところ、20μMの銅、カドミウムイオンで顕著な生育阻害があることを見いだした。(3)C.elegans Cu^<2+>ポンプATPaseの発現様式を調べるため、先ずそのゲノムDNAをクローン化した。本遺伝子は第3番染色体上にあり、その5′上流には重金属応答性のプロモーターが存在していた。次に、その領域をβ-galactosidaseおよびgreen fluorescent proteinをコードする遺伝子と融合し、C.elegansに導入し、レポーターとして用いて本酵素を特異的に発現している細胞を検索した。本酵素は主に虫体先端部の咽頭筋に発現していることを明らかにした。咽頭は直接外部と接触していることから、本酵素が外部からの重金属イオンの取り込みあるいは吐き出しに関わっていると考えている。

（1）对于C.Elegans Cu^<2+>泵ATPase的生化分析，使用酵母建立了该cDNA的表达系统。使用PCR方法，将酶替换为氨基酸，并在酵母中表达，并鉴定出对其功能必不可少的氨基酸序列（Cys-Pro-cys，Asp-Lys-thr-gly）。此外，使用同一系统分析了人Cu^<2+>泵ATPase（Wilson的致病基因）的功能。（2）研究Cu^<2+>泵浦ATPase在C.Elegans中的作用，筛选了插入Cu^<2+>泵ATPase基因的转座子的菌株以产生Cu^<2+>泵浦ATP酶缺陷突变体。目前，正在阐明重金属离子异常发育或异常代谢是否不会发生在产生的缺陷突变体中。同时，我们研究了野生生长是否受重金属离子的存在影响，发现20μM铜和镉离子显示出明显的生长特技。（3）研究C.Elegans Cu^<2+>泵ATPase的表达模式，首先将基因组DNA克隆。该基因在3染色体上，并且存在重金属响应启动子的上游。然后将该区域与编码β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白的基因融合，并引入秀丽隐杆线虫，并用作记者，以寻找专门表达酶的细胞。据显示，该酶主要在生殖器体尖端的咽肌中表达。由于咽部与外部直接接触，因此据信这种酶参与从外部摄取或排出重金属离子。