線虫C．elegansのCu＾＜2＋＞ポンプATPaseの構造と機能に関する研究

线虫 C.

基本信息

批准号：
09760302
负责人：
三本木至宏
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760302/
关键词：
線虫重金属イオントランスポーター

项目摘要

(1)C.elegans Cu^<2+>ポンプATPaseの生化学的な機能解析のため、酵母を用いて本cDNAの発現系を確立した。PCRの手法を用いて本酵素にアミノ酸置換を施し酵母で発現させ、機能に必須であるアミノ酸配列(Cys-Pro-Cys、Asp-Lys-Thr-Gly)を同定した。さらに、ヒトのCu^<2+>ポンプATPase(Wilson病原因遺伝子)についても同様の系で機能を解析した。(2)Cu^<2+>ポンプATPaseのC.elegansにおける役割を調べるため、Cu^<2+>ポンプATPase遺伝子にトランスポゾンが挿入された株をスクリーニングし、Cu^<2+>ポンプATPase欠損変異株を作製した。現在、得られた欠損変異体に、発生の異常、あるいは重金属イオンの代謝異常などが起こらないかどうかを明らかにしている。また同時に、野生体の生育が重金属イオンの存在で影響されるかどうか調べたところ、20μMの銅、カドミウムイオンで顕著な生育阻害があることを見いだした。(3)C.elegans Cu^<2+>ポンプATPaseの発現様式を調べるため、先ずそのゲノムDNAをクローン化した。本遺伝子は第3番染色体上にあり、その5′上流には重金属応答性のプロモーターが存在していた。次に、その領域をβ-galactosidaseおよびgreen fluorescent proteinをコードする遺伝子と融合し、C.elegansに導入し、レポーターとして用いて本酵素を特異的に発現している細胞を検索した。本酵素は主に虫体先端部の咽頭筋に発現していることを明らかにした。咽頭は直接外部と接触していることから、本酵素が外部からの重金属イオンの取り込みあるいは吐き出しに関わっていると考えている。

(1)为了对线虫Cu^2+泵ATP酶进行生化功能分析，我们使用酵母建立了该cDNA的表达系统。使用PCR技术，我们对该酶进行了氨基酸替换，并在酵母中表达它，并鉴定了对其功能至关重要的氨基酸序列（Cys-Pro-Cys、Asp-Lys-Thr-Gly）。此外，我们使用类似的系统分析了人类Cu 2+ 泵ATP酶(威尔逊氏病致病基因)的功能。 (2)为了研究Cu^2+泵ATPase在秀丽隐杆线虫中的作用，我们筛选了Cu^2+泵ATPase基因插入转座子的菌株，并创建了突变株。目前，我们正在研究由此产生的缺失突变体是否不表现出发育异常或重金属离子代谢异常。同时，我们调查了野生植物的生长是否受到重金属离子存在的影响，发现20μM的铜和镉离子显着抑制生长。 (3)为了研究线虫Cu^2+泵ATPase的表达模式，我们首先克隆了其基因组DNA。该基因位于 3 号染色体上，重金属响应启动子位于其 5' 上游。接下来，将该区域与编码β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白的基因融合，引入线虫中，并用作报告基因来寻找特异性表达该酶的细胞。研究表明，这种酶主要表达于昆虫体尖端的咽肌中。由于咽部与外界直接接触，我们认为这种酶参与了外界重金属离子的摄取或排出。