植物の成熟を制御するACC deaminaseの立体構造決定とその制御機構の解明

控制植物成熟的ACC脱氨酶三维结构的测定及其控制机制的阐明

基本信息

批准号：
09760063
负责人：
中川敦史
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

植物の成長ホルモンであるエチレンの生合成前駆体である1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)を脱アミノ化して,2-オキソ酪酸に変換する酵素ACC deaminaseの立体構造をX線結晶構造解析法により解明し,その反応機構を原子レベルで解明することを目的として研究を進めた.構造解析は,大腸菌で大量発現した酵母由来のACC deaminaseを用いて行った.シンクロトロン放射光を使って回折強度データ収集を行い,ネイティブ(分解能2.A),PHMBS共結晶の高分解能(2.5A以上)の回折強度データを得ることができた.本研究では,すべて結晶を100Kに冷却した条件でデータ収集を行ったため,結晶間での同型性が崩れ,また,PHMBS共結晶では,別の結晶系のものも得られた.このため,位相決定は,PHMBS共結晶を用いた多波長異常分散法により行い,さらに,同一結晶内での分子内および結晶系の異なる結晶間での非結晶学的な分子の対称性を利用した分子置換平均化法を用いて位相改良を行った結果,解釈可能な電子密度図を得ることができた.この電子密度図に基づいて,立体構造モデルを作製し,分子動力学的手法を用いた精密化を行った結果,水分子825個を構造因子の計算に含め,分解能8-2.0AでR-factorが24.9%、(R_<Free>=28.2%)の構造を得ることができた.酵母ACC deaminaseは,ホモ二量体として存在し,それぞれの単量体分子は,大小2つのドメイン構造をとっていた.大きな方のドメインは,N末端およびC末端の領域(1-57,170-341)から構成され,補酵母であるpyridoxal phosphate(PLP)が結合している.小さな方のドメインは,中央の領域(58-169)から構成され,基質結合に関与していると考えられる.

ACC 脱氨酶三维结构的 X 射线晶体结构分析，ACC 脱氨酶是一种将 1-氨基环丙烷-1-羧酸 (ACC) 脱氨基并将其转化为 2-氧代丁酸的酶，ACC 是乙烯（一种植物生长激素）的生物合成前体我们进行研究的目的是在原子水平上阐明反应机制。对在大肠杆菌中大量表达的酵母来源的 ACC 进行了结构分析。使用同步加速器辐射收集衍射强度数据，我们能够获得原生（分辨率 2.A）和 PHMBS 共晶体的高分辨率（2.5A 或更高）衍射强度数据。由于数据是在晶体冷却至100K的条件下采集的，晶体之间的同构性被打破，在PHMBS共晶中，也得到了不同的晶系。为此，采用PHMBS进行物相测定这是通过使用晶体的多波长反常色散法来进行的。通过使用分子取代平均方法进行相改进，该方法利用同一晶体内的分子内以及不同晶体系统的晶体之间的非晶体分子对称性，我们获得了可解释的电子密度。基于该电子密度图的维度结构模型。通过创建模型并使用分子动力学方法对其进行细化，结构因子的计算中包含了 825 个水分子，在分辨率为 8-2.0A 时，R 因子为 24.9%（R_<Free>） =28.2%）。脱氨酶以同型二聚体形式存在，每个单体分子具有大小两个结构域。较大的结构域从N端和C端区域延伸（1-57、170-341），较小的结构域由中心区域 (58-169)，被认为参与底物结合。