耐熱性古細菌由来のシャペロニン蛋白質の性質決定

热稳定古菌伴侣蛋白的表征

基本信息

批准号：
08780627
负责人：
溝端知宏
金额：
$ 0.51万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では耐熱性を持つ細菌内における蛋白質の構造形成反応に関する知見を得るため,超好熱性古細菌Pyrococcus furiosus由来のシャペロニン蛋白質の均一精製及びその性質の解明を試みた。なお,本蛋白質の遺伝子はすでに得られており,今回の研究では大腸菌内でその遺伝子を発現させたものからシャペロニンを均一に精製し,その基本的な性質決定を行った。Pyrococcus furiosus由来のシャペロニン蛋白質は大腸菌内で可溶蛋白質として発現され,90℃の熱処理,硫安分画,及び数種類のカラムクロマトグラフィーにより均一に精製された。電気泳動分析によりPyrococcus furiosus由来のシャペロニンはサブユニット分子量約5万6千のポリペプチド鎖からなり,またゲル濾過カラムクロマトグラフィー分析から室温では本蛋白質は6から8量体のオリゴマーを形成していることが明らかになった。不思議なことに,本蛋白質は精製途中にN末端部分がプロテアーゼの作用を受けやすいことがアミノ酸配列分析から明らかになり,好熱性細菌由来の蛋白質にしては意外にも不安定な一面が明らかになった。更に興味深いことに今回精製されたシャペロニンは,シャペロニンの基礎的な性質の一つであるATPアーゼ活性は観測されなかった。今後の実験の方針として,実際の蛋白質の構造形成反応における効果の有無を確かめること,更にシャペロニンとしての効果を発現する際に今回精製されたシャペロニン蛋白質が他の補助因子を必要とするかどうかを明らかにしていく予定である。

在这项研究中，为了获得有关耐热细菌蛋白质形成反应的知识，我们试图从过度疗法的古细菌富洛氏菌中统一纯化伴侣蛋白并阐明其特性。该蛋白的基因已经获得，在这项研究中，伴侣蛋白是从大肠杆菌中表达的基因均匀纯化的，并确定了碱性特性。源自富洛氏菌的伴侣蛋白表示为大肠杆菌中的可溶性蛋白，并通过在90°C的热处理，硫酸铵分馏和几种不同的柱色谱法中均质纯化。电泳分析表明，源自中心菌的伴侣蛋白是由多肽链组成的，其亚基分子量约为56,000，而凝胶过滤柱色谱分析表明，蛋白质在室温下形成6-8-8-8-Mer的寡头。奇怪的是，氨基酸序列分析表明，该蛋白质的N末端部分容易受到纯化过程中蛋白酶的作用，这表明源自嗜热细菌的蛋白质令人惊讶地不稳定。更有趣的是，这次纯化的伴侣蛋白没有观察到ATPase活性，这是伴侣蛋白的基本特性之一。作为未来的实验策略，我们将检查实际蛋白是否对结构形成反应有效，并阐明纯化的伴侣蛋白蛋白是否需要其他辅助因子作为伴侣蛋白的作用。