一酸化窒素合成酵素(複合ヘムフラビン蛋白質)の機能解析

一氧化氮合酶（复合血黄素蛋白）的功能分析

• 批准号: 08780599
• 负责人: 岩崎 俊雄
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780599/
• 关键词: 一酸化窒素合成酵素; ヘム; シトクロムP450

脳神経型NO合成酵素(nNOS)ヘム結合ドメインの発現:NO生成の場であるnNOSのヘム中心を分光学的により詳細に検討するため、ヘム結合ドメインをグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌で発現させる系を構築した。グルタチオン存在下、アフィニティーカラムを用いて精製したところ、ヘム中心のCO結合能には影響をあたえずに微環境が変化することを見い出し、現在さらに解析している。全ドメインを含むnNOSの発現:昆虫培養細胞および大腸菌発現系を用いてマウスnNOS遺伝子を発現させ、活性型酵素として精製することにも成功した。さらにnNOSの新規活性化/安定化物質の一つとしてリン脂質が関与していることを新たに発見したので、この系をもちいて、その効果をより詳細に解析することも可能になった。nNOS変異酵素の発現と解析:NC合成酵素ヘム結合ドメインはシトクロムP450と分光学的に類似していることが示唆されているため、まずシトクロムP450ファミリーによく保存されている機能的に重要なトレオニン残基があるかどうかを検討した。NO合成酵素ヘム結合ドメインに高度に保存されているトレオニン残基のひとつをアラニンに置換した変異体を作成し、大腸菌発現系を用いて発現させ、これが機能的でななく構造的に重要であることを示した。続いて、脳に特異的に発現されている不活性型のnNOS遺伝子オルターナティブ・スプライシング産物のヘム結合ドメインを発現させて調べたところ、還元型にするとこれが容易にシトクロムP420型になることも見い出した。これらの変異酵素および野生型nNOSについては、さらに詳細な解析を行う予定である。すなわち、本研究最大の成果は、多量のサンプルを必要とする物理化学的手法を適用して将来的にnNOS活性中心の構造を詳細に解析するための展望が開けた点にある。

神经元 NO 合酶 (nNOS) 的血红素结合域的表达：为了检查 nNOS 的血红素中心（NO 产生位点），更详细地进行光谱分析，将血红素结合域用作与谷胱甘肽的融合蛋白大肠杆菌中的 S-转移酶 我们构建了一个系统来表达这一点。当在谷胱甘肽存在下使用亲和柱纯化时，我们发现微环境发生了变化，但不影响以血红素为中心的CO结合能力，目前我们正在进行进一步分析。包含所有结构域的 nNOS 的表达：我们使用培养的昆虫细胞和大肠杆菌表达系统表达小鼠 nNOS 基因，并成功纯化了活性酶。此外，由于我们新发现磷脂作为 nNOS 的新激活剂/稳定剂，因此可以使用该系统更详细地分析其作用。 nNOS突变酶的表达和分析：由于NC合酶血红素结合域在光谱上与细胞色素P450相似，因此我们首先研究是否存在任何残基。我们创建了一种突变体，其中 NO 合酶的血红素结合域中高度保守的苏氨酸残基之一被丙氨酸取代，并使用大肠杆菌表达系统进行表达，并证明这不仅具有功能性，而且在结构上也很重要。结果表明接下来，我们表达并研究了非活性nNOS基因的选择性剪接产物的血红素结合域，该基因在大脑中特异性表达，发现当还原时，它很容易变成细胞色素P420形式。我们计划对这些突变酶和野生型 nNOS 进行更详细的分析。换句话说，这项研究的最大成果是为未来通过应用需要大量样本的物理化学方法来详细分析nNOS活性中心的结构打开了大门。

项目成果

岩崎俊雄,他6名: "神経型NO合成酵素alternative splicing産物nNOS 2のヘム結合ドメイン" 生体機能における金属イオンの特異的作用の分子科学. 74- (1996)

Toshio Iwasaki 等 6 人：“神经元 NO 合酶选择性剪接产物 nNOS 2 的血红素结合域”金属离子对生物功能的特定影响的分子科学 74-（1996）。

堀弘幸,岩崎俊雄,他2名: "脳神経型一酸化窒素合成酵素活性化/安定化物質の検索" 生化学. 68・7. 1009- (1996)

Hiroyuki Hori、Toshio Iwasaki 等 2 人：“寻找脑神经型一氧化氮合酶的激活/稳定物质”生物化学 68・7。

岩崎俊雄,他3名: "NO合成酵素ヘム結合ドメインとシトクロムP450とのトポロジーの比較" 生化学. 68・7. 663- (1996)

Toshio Iwasaki 等 3 人：“NO 合酶血红素结合结构域和细胞色素 P450 的拓扑结构的比较”生物化学 68・7。

IWASAKI.T.,他3名: "Heme-binding domain and the threonine mutants of mouse neuronal nitric oxide synthase" Journal of Inorganic Chemistry. (印刷中). (1997)

IWASAKI.T. 和其他 3 人：“小鼠神经元一氧化氮合酶的血红素结合域和苏氨酸突变体”无机化学杂志（1997 年）。

堀弘幸,岩崎俊雄,他3名: "脳神経型一酸化窒素合成酵素を活性化/安定化する脂溶性物質" 生体機能における金属イオンの特異的作用の分子科学. 77- (1996)

Hiroyuki Hori、Toshio Iwasaki 等 3 人：“激活/稳定脑神经型一氧化氮合酶的脂溶性物质”金属离子对生物功能的特定影响的分子科学 77- (1996)。