ゼラチナーゼAの活性発現・制御機構の解析

明胶酶A活性表达及调控机制分析

基本信息

批准号：
08780564
负责人：
東昌市
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アルツハイマー痴呆症は、脳内に蓄積したβアミロイド蛋白質(βAP)により、神経細胞が変性死することが主要な原因と考えられている。βAPは細胞内でより分子量の大きな細胞膜結合型の前駆体蛋白質(APP)として合成された後、細胞内プロテアーゼにより分解される過程で切り出される。一方、APPが細胞表層において未知のプロテアーゼ(α-secretase)で切断されるとAPPの細胞外領域(sAPP)が切り出され、βAPを産生することはない。私達はこれまでマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の一つであるゼラチナーゼAがα-secretaseとして働く仮説を提唱してきた。本年度はこの仮説を検証するために、培養細胞を用いてsAPPの分泌に及ぼすMMPインヒビターの影響を調べた。1)まず、ヒト繊維肉腫由来HT1080細胞をコンカナバリンA(ConA)で処理すると細胞培養液中のゼラチナーゼA前駆体が活性化されるとともに、sAPP(120kDa)より分子量の低いAPPの分解断片(80〜90kDa)が生じることを見い出した。2)このAPP分離断片は細胞培養液に天然のMMPインヒビターであるTIMP-2や合成MMP阻害剤を添加すると消失した。3)モノクローナル抗体を用いて解析した結果、APP分解断片はsAPPのCOOH末端領域が欠如した分子であることが判明した。4)溶液中でsAPPにゼラチナーゼAを作用させても分解断片を生じないことから、APPの分解は細胞膜表層で起きていると推定された。5)sAPPの分泌はTIMP-2で抑制されないことから、細胞におけるα-secretase活性はMMP以外の酵素が担っていることが示唆された。以上の結果から、当初の予想とは異なり、MMPがα-secretaseとして働く可能性が低いことが示唆された。一方、1)〜4)の結果はα-secretaseに依存しない新しいAPP細胞外領域の放出機構にゼラチナーゼA、あるいはゼラチナーゼA前駆体の活性化因子であるMT-MMPが関わることを示唆している。このMMPによるAPPの細胞外分解経路ではβAP領域内での切断が起きないことから、βAPの産生・蓄積に関与する可能性があり、興味深い。

阿尔茨海默氏痴呆症的主要原因被认为是由于大脑中积累的β-淀粉样蛋白（βAP）导致神经细胞变性和死亡。 βAP在细胞内合成为分子量较大的细胞膜结合前体蛋白（APP），然后在被细胞内蛋白酶降解的过程中被切除。另一方面，当APP在细胞表面被未知的蛋白酶（α-分泌酶）裂解时，APP的胞外区域（sAPP）被切除，不再产生βAP。我们提出了这样的假设：明胶酶 A（一种基质金属蛋白酶 (MMP)）充当 α 分泌酶。今年，为了验证这一假设，我们使用培养细胞研究了 MMP 抑制剂对 sAPP 分泌的影响。 1）首先，当用刀豆球蛋白A（ConA）处理人纤维肉瘤来源的HT1080细胞时，细胞培养基中的明胶酶A前体被激活，并且发现APP（80~90kDa）的降解片段发生。 2) 当将 TIMP-2（一种天然 MMP 抑制剂或合成 MMP 抑制剂）添加到细胞培养基中时，该分离的 APP 片段消失。 3)使用单克隆抗体分析表明APP降解片段是缺少sAPP COOH末端区域的分子。 4) 由于当明胶酶 A 作用于溶液中的 sAPP 时，没有产生降解片段，因此推测 APP 降解发生在细胞膜表面。 5) TIMP-2 不抑制 sAPP 分泌，表明除了 MMP 之外还有一种酶负责细胞中的 α-分泌酶活性。上述结果表明，与最初的预期相反，MMP 不太可能充当α-分泌酶。另一方面，结果 1) 至 4) 表明明胶酶 A 或 MT-MMP（明胶酶 A 前体的激活剂）参与了 APP 胞外结构域的新的不依赖于 α-分泌酶的释放机制。 MMP 胞外降解 APP 的这条途径不涉及 βAP 区域内的裂解，这一点很有趣，因为它可能涉及 βAP 的产生和积累。