LC-MS/MSを用いたリウマチ治療に用いる抗体医薬品の血中濃度測定法の確立

LC-MS/MS风湿治疗用抗体药物血药浓度测定方法的建立

• 批准号: 24926013
• 负责人: 中村 浩規
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24926013/
• 关键词: Infliximab; LC-MS/MS; 血中濃度測定

本申請研究では、関節リウマチ患者やクローン病患者などに対して用いられる抗体医薬品インフリキシマブ(IFX)の血中濃度測定による薬物動態解析や、IFXに対する抗体(抗IFX抗体)の発現機序解明のための重要なツールとなりうる"LC-MS/MS法を用いたIFXおよび抗IFX抗体の濃度測定法の確立"を目的として検討を行った。第一に、IFXおよびヒト血液中のタンパク質をタンパク分解酵素により断片化しSDS-PAGE法を用いて未処理のIFXやヒト血液中のタンパク質と分子量を比較することで最も消化効率の良い前処理条件を検討した。第二に、得られたサンプルをLC-MS/MSで分析し、主成分解析(PCA解析)を行うことでIFX特有のイオンピークを複数種類抽出した。これらのピークのうち、比較的強いピーク強度を有し、なおかつIFXを含むサンプルに特異的に存在するピークを選択してIFXの濃度測定を行った。その結果、前処理条件としてはジチオスレイトールによる還元処理、ヨードアセトアミドによるアセチル化処理およびトリプシンによるタンパク断片化としてについて最適な前処理条件を設定することが出来た。次に、PCA解析によって得られた複数種類のIFX特異的なピークのうちで最も強度が強かったイオンピークについてproductionの探索を行った結果、最も特異的かつ強度の強いイオンピークを得ることが出来た。そしてブランク血清にIFXを添加したサンプルを測定した結果、絶対検量線法ではあるがこれまで報告されているIFXの血中濃度範囲におけるリニアな検量線を得ることが出来た。現在は、固相抽出によるイオンサプレッションの軽減やサンプルの濃縮などによる感度向上を目的とした検討を行っている。

在本次提交的研究中，我们将通过测量血药浓度来分析用于类风湿关节炎和克罗恩病患者的抗体药物英夫利昔单抗（IFX）的药代动力学，并阐明抗IFX抗体（抗IFX）的表达机制。这项研究的目的是“建立一种使用 LC-MS/MS 测量 IFX 和抗 IFX 抗体浓度的方法”，这可能是一个重要的研究工具。首先，我们使用蛋白水解酶将人血液中的 IFX 和蛋白质片段化，并使用 SDS-PAGE 将其分子量与人血液中未处理的 IFX 和蛋白质进行比较，以找到我们考虑的最有效的预处理条件。其次，通过LC-MS/MS对得到的样品进行分析，通过主成分分析（PCA分析）提取出IFX特有的多种离子峰。在这些峰中，选择具有相对强的峰强度并且特异存在于含有IFX的样品中的峰来测量IFX的浓度。结果，我们能够为二硫苏糖醇的还原处理、碘乙酰胺的乙酰化处理以及胰蛋白酶的蛋白质断裂设定最佳的预处理条件。接下来，我们对通过 PCA 分析获得的多种 IFX 特异峰中最强烈的离子峰进行了产生式搜索，结果，我们能够获得最特异、最强烈的 Ta 离子峰。对在空白血清中添加IFX的样品进行测定，虽然是绝对校准曲线法，但在迄今报道的IFX血药浓度范围内得到了线性校准曲线。目前，我们正在研究通过固相萃取和浓缩样品减少离子抑制来提高灵敏度的方法。