糖感受性アスパラギン合成酵素の2型糖尿病発症における機能解析

糖敏感性天冬酰胺合酶在2型糖尿病发病过程中的功能分析

• 批准号: 22930008
• 负责人: 飯田 慎也
• 金额: $ 0.36万
• 依托单位: Asahikawa Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22930008/
• 关键词: 2型糖尿病; 糖代謝; インスリンシグナル伝達

【研究目的】Asparagine synthetase (Asns)は肝細胞内での糖代謝、およびマウスの血糖調節に関与する可能性がこれまでの実験結果から示唆されている。本研究は肝細胞においてAsnsと、糖代謝及びインスリンシグナルに関わる遺伝子群との相互作用メカニズムを明らかにすることを目的としている。【研究方法】マウス肝細胞由来Hapel-6細胞を用いて、Asns遺伝子の発現が亢進する低グルコース培養条件下(5、10mM)でAsns遺伝子ノックダウン実験を行った。リポフェクション法を用いてHepal-6細胞にAsnsに対するsiRNAを導入し12時間培養後、培地を5、10、25mMのグルコース含有培地に置換しさらに24時間培養した。各培養条件におけるGlucokinase (GCK)の遺伝子発現変動をリアルタイムPCR法で定量し(研究実施計画・実験(1))、GCKの蛋白量およびインスリンシグナル伝達系の主要因子であるAkt、JNKのリン酸化蛋白量の変化をウエスタンブロッティング法で検出した(研究実施計画・実験(2))。【研究成果】Asnsのノックダウン効率は平均して約54%であった。現在までのところ、いずれの実験条件においてもGCKの安定した遺伝子発現定量の結果は得られていない。その理由としてHepal-6細胞ではGCKの発現量が低いことが考えられる。同様にGCK蛋白量についても各実験条件の間で変化は見られていない。一方、Asnsノックダウン時の低グルコース培養条件においてリン酸化Akt蛋白量が増加し、また低グルコース培養条件単独でリン酸化JNK蛋白量を増加させる可能性のあることが、ウエスタンブロッティング法による実験結果から示唆された。この結果は、細胞中のAsns蛋白量や培地中のグルコース濃度の変化がAktとJNKのリン酸化調節に影響を及ぼす可能性を示すものである。現在までにAsns遺伝子が肝臓でのインスリンシグナル伝達に関与するとの報告はなく、今回の実験結果はAsns遺伝子と糖代謝やインスリン抵抗性との関わりを考える上で、新規かつ重要な知見である。今後は、実験の再現性や条件を詳細に検討して研究を進める予定である。

[研究目的]前期实验结果表明天冬酰胺合成酶(Asns)可能参与肝细胞葡萄糖代谢和小鼠血糖调节。本研究的目的是阐明Asns与肝细胞中参与葡萄糖代谢和胰岛素信号传导的基因之间的相互作用机制。 [研究方法] 使用小鼠肝细胞来源的 Hapel-6 细胞在低糖培养条件（5、10mM）下进行 Asns 基因敲除实验，其中 Asns 基因表达增强。使用脂转染法将针对Asns的siRNA导入Hepal-6细胞中，培养12小时后，将培养基更换为含有5、10或25mM葡萄糖的培养基，并将细胞进一步培养24小时。通过实时PCR（研究实施计划/实验（1））定量每种培养条件下葡萄糖激酶（GCK）基因表达的变化，以及GCK的蛋白水平和Akt和JNK的磷酸化，这是影响细胞生长的主要因素。通过蛋白质印迹法检测胰岛素信号转导系统的蛋白质水平的变化（研究计划/实验（2））。 [研究结果] Asns的击倒效率平均约为54%。迄今为止，在任何实验条件下尚未获得稳定的GCK基因表达定量结果。其原因可能是Hepal-6细胞中GCK的表达水平较低。同样，在不同的实验条件下，GCK 蛋白的量也没有观察到变化。另一方面，使用蛋白质印迹的实验结果表明，在Asns敲低期间，磷酸化Akt蛋白的量在低葡萄糖培养条件下增加，并且表明磷酸化JNK蛋白的量可能在单独低葡萄糖培养条件下增加。该结果表明细胞内Asns蛋白量和培养基中葡萄糖浓度的变化可能影响Akt和JNK磷酸化的调节。迄今为止，还没有Asns基因参与肝脏胰岛素信号转导的报道，本实验结果在考虑Asns基因与糖代谢和胰岛素抵抗之间的关系时是新的重要发现。未来，我们计划通过详细检查实验的再现性和条件来继续我们的研究。