遺伝子コード型センサーのハイスループット選別法の最適化

基因编码传感器高通量筛选方法的优化

• 批准号: 16H00614
• 负责人: 杉浦 琴美
• 金额: $ 0.36万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16H00614/
• 关键词: ハイスループットスクリーニング; 蛍光センサー; 大腸菌

分子生物学的手法を用いた遺伝子コード型センサーのハイスループット選別法の最適化を行い、効率的な蛍光センサーの開発方法の確立を行った。細胞外刺激により生じるイノシトール1, 4, 5三リン酸(IP3)や細胞内Ca2+濃度上昇は、遺伝子発現、シナプス可塑性や細胞死などの様々な生理現象を制御するため、細胞内のIP3やCa2+濃度変化を検出する遺伝子コード型蛍光センサーは、生理現象の誘導機構の解明には必要不可欠なツールである。所属研究室では、効率的に遺伝子コード型蛍光センサーを開発するために、ランダム遺伝子変導入法と併用した、大腸菌内で蛍光センサーの蛍光変化を従来より高感度で検出できるハイスループット選別法を開発した。このシステムでは、蛍光センサーにペリプラズム移行シグナル(TorA)を付加することで、蛍光センサーをIP3やCa2+などの低分子化合物が透過可能なペリプラズムに移行させ、細胞外から低分子化合物を添加することで、蛍光強度変化を大腸菌内で測定でき、変化率の大きな蛍光センサーを選抜できる。本研究では、このハイスループット選別法のさらなる効率化を目指し、研究(1)最適なTorAシグナルと発現用大腸菌の組合せの決定、および研究(2)蛍光センサーへの効率的なランダム遺伝子変異導入法の検証を行った。研究(1)により蛍光センサーを大腸菌のペリプラズムに効率的に移行させることのできる遺伝子発現ベクターの種類、TorAシグナル配列、大腸菌株の組合せを特定した。そして、蛍光センサーのハイスループット選別法として論文を発表した。研究(2)では、これまでに報告されたランダム遺伝子変異導入法(error prone PCRやヒドロキシルアミン法等)を比較および最適化した。その結果、反応回数を増やすことでError prone PCRにより効率的に遺伝子変異を導入できる事が分かった。

我们利用分子生物学方法优化了基因编码传感器的高通量选择方法，并建立了开发荧光传感器的有效方法。细胞外刺激引起的肌醇 1、4、5 三磷酸 (IP3) 和细胞内 Ca2+ 浓度的增加控制着各种生理现象，例如基因表达、突触可塑性和细胞死亡。生理现象的诱导机制。为了高效地开发基因编码荧光传感器，我的实验室开发了一种高通量选择方法，结合随机基因突变方法，可以比常规方法更高的灵敏度检测大肠杆菌中荧光传感器的荧光变化。 。在该系统中，通过向荧光传感器添加周质迁移信号（TorA），将荧光传感器转移到IP3和Ca2+等低分子量化合物可以渗透的周质，并通过从细胞外添加低分子量化合物，可以测量大肠杆菌内荧光强度的变化，并选择变化率较大的荧光传感器。在本研究中，我们的目标是通过（1）确定TorA信号和表达大肠杆菌的最佳组合，以及（2）开发一种将随机基因突变引入荧光的有效方法，进一步提高这种高通量选择方法的效率。我们进行了验证。通过研究（1），我们鉴定了基因表达载体、TorA信号序列和大肠杆菌菌株的组合，可以有效地将荧光传感器转移到大肠杆菌的周质中。随后他发表了一篇关于荧光传感器高通量筛选方法的论文。在研究（2）中，我们对之前报道的随机基因诱变方法（易错PCR、羟胺法等）进行了比较和优化。结果表明，通过增加反应次数，可以使用易错 PCR 有效引入基因突变。

项目成果

Development of a convenient and supersensitive high-throughput screening system for genetically encoded fluorescent probes of small molecules using a confocal microscope

使用共焦显微镜开发一种方便且超灵敏的小分子基因编码荧光探针高通量筛选系统

• DOI: 10.1016/j.ceca.2016.09.007
• 发表时间: 2016
• 期刊: Cell Calcium.
• 作者: Miyamoto A;Sugiura K; Mikoshiba K.
• 通讯作者: Mikoshiba K.