三量体G蛋白質βγサブユニットによるアクチン細胞骨格と細胞接着の制御機構の解明

阐明三聚体G蛋白βγ亚基对肌动蛋白细胞骨架和细胞粘附的控制机制

基本信息

批准号：
12771430
负责人：
上田浩
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、三量体G蛋白質βγによる細胞接着・運動の制御機構を調べている過程で発見したHeLa細胞における三量体G蛋白質Gα11による強い接着斑様構造形成のメカニズムを検討した。以前、HeLa細胞にGβγを発現させると、活性型Gα12と同様にアクチンストレスファイバーと接着斑の形成を引き起こすことを報告した。これらの形成はRhoのドミナントネガティブ変異体とRhoキナーゼ阻害剤Y-27632により阻害されることから、Rho、Rhoキナーゼ依存性と考えられる。一方、活性化型Gα11を発現させるとストレスファイバーは見られないが、ビンキュリン抗体で強く染色される接着斑様の構造が形成された。この形成はRhoキナーゼ依存性であるが、Rhoには非依存性であった。HeLa細胞では活性化型Gα11の発現によりカスパーゼが活性化され、アポトーシスが誘導されること、活性化されたカスパーゼによりRhoキナーゼROCK-Iの切断が起こることが判明した。切断部位はAsp-1113で、N端側のフラグメントは活性化型であることを示した。また、Gq/11を活性化するm1ムスカリン性アセチルコリン受容体刺激でもROCK-Iの切断が起こり、ビンキュリンを含む接着斑様の構造を形成することから生理的条件下でも起こる反応と考えられる。本研究では、ROCK-IのC末端側が切除されて活性化されるというRhoを介さないRhoキナーゼの活性化機構が明らかになった。G11からカスパーゼ活性化への伝達機構は今後の課題であるが、Gq/11のよく知られた下流の反応であるプロテインキナーゼCの阻害剤やCa^<2+>のキレート剤では活性型Gα11によるROCK-Iの切断は抑制されなかったので、これらを介するシグナル伝達ではないと考えられる。活性型Gα11をNIH3T3細胞に発現してもアポトーシスは誘導されず、細胞特異性のある反応であった。一連の反応に関与する分子の内おそらく少なくともどれか1つがNIH3T3細胞には欠けていると推定される。

今年，我们研究了三聚体G蛋白Gα11在HeLa细胞中形成强粘着斑样结构的机制，这是我们在研究三聚体G蛋白βγ对细胞粘附和运动的控制机制时发现的。我们之前报道过，在 HeLa 细胞中表达 Gβγ 会导致肌动蛋白应力纤维和粘着斑的形成，类似于活性 Gα12。由于这些形成受到 Rho 显性失活突变体和 Rho 激酶抑制剂 Y-27632 的抑制，因此认为它们依赖于 Rho 和 Rho 激酶。另一方面，当表达活化的Gα11时，没有观察到应力纤维，但形成了被纽蛋白抗体强烈染色的粘着斑样结构。该形成依赖于 Rho 激酶，但又不依赖于 Rho。我们发现激活的 Gα11 的表达会激活 caspase 并诱导 HeLa 细胞凋亡，并且激活的 caspase 会导致 Rho 激酶 ROCK-I 的裂解。切割位点为Asp-1113，N端片段显示为激活形式。此外，刺激激活Gq/11的m1毒蕈碱乙酰胆碱受体也会导致ROCK-I裂解，形成含有纽蛋白的粘着斑样结构，表明这种反应即使在生理条件下也会发生。这项研究揭示了 Rho 激酶的非 Rho 介导的激活机制，其中 ROCK-I 的 C 端侧被切除并激活。从G11到caspase激活的传递机制是一个未来的问题，但是蛋白激酶C的抑制剂(Gq/11众所周知的下游反应)和Ca^2+的螯合剂可有效促进Gα11的激活。由于ROCK-I的裂解未被抑制，因此认为信号转导不是由这些介导的。 NIH3T3 细胞中活性 Gα11 的表达不会诱导细胞凋亡，表明存在细胞特异性反应。据估计，NIH3T3细胞可能缺乏至少一种参与一系列反应的分子。