Islet-3の眼胞・中脳後脳境界部形成における機能解析

Islet-3视泡/中脑-后脑边界形成的功能分析

基本信息

批准号：
09780692
负责人：
菊池裕
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research (1998)Keio University (1997)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780692/
关键词：
Zebrafish LIM Homeodomain Protein Islet-3 Eye development Two-Hybrid System

项目摘要

LIM/ホメオドメイン蛋白は、zinc-finger様構造をしたLIMドメインとホメオドメインという2つの特徴あるドメインを有している。LIM/ホメオドメイン蛋白のin vitroでの機能解析の結果、LIMドメインはホメオドメインのDNAへの結合能を阻害するという実験結果が得られている。そのため、LIM/ホメオドメイン蛋白が活性化する時は、別の共役因子が発現し、これがLIMドメインと結合することによって、LIMドメインのホメオドメインへの阻害効果が解除されるというモデルが提唱されている。私はこのモデルに従い、ゼブラフィッシュ胚の中枢神経系で眼と視蓋に特異的に発現しているIslet-3のLIMドメインのみを過剰発現させ、内因性Islet-3の細胞内の共役因子を吸収することにより、Islet-3の機能を特異的に阻害する実験を行なった。その結果、眼胞・中脳後脳境界部(小脳原基)が完全に形成されず、Islet-3は、眼胞・中脳後脳境界部の形成において直接・間接的に重要な役割を持つことが明らかになった。私は、眼胞・中脳後脳境界部の形成におけるIslet-3の機能を明確にすることを目的に、Islet-3のLIMドメインに特異的に結合する共役因子の探索を行った。蛋白質間相互作用を用いた遺伝子スクリーニング法としては酵母を用いたyeast two-hybrid法、または発現ファージライブラリーを用いたfar-westem法などが知られている。two-hybridsystemでは、酵母内のタンパクとIslet-3のLIMドメインが相互作用してしまうことから、この系でのスクリーニングは困難であることが明らかとなった。far-westernは、Islet-3のLIMドメインとGSTとの融合蛋白をプローブとして用い、ゼブラフィッシュ22〜26時間胚発現cDNAライブラリー120万クローンに対してスクリーニングを行った。その結果、Islet-3のLIMドメインと特異的に相互作用する核タンパクとしてLANP(Leucine rich Acidic Neuclear Protein)が得られた。この核タンパクは、ラットに於いて生後小脳プルキンエ細胞で発現し、小脳の発生・回路形成などが進むにつれて発現が上昇することが報告されている。現在、中脳後脳境界部の形成におけるIslet-3・LANP複合体の役割を明らかにするため、解析を行っている段階である。さらに私は、Islet-3のLIMドメインを過剰発現させた胚では眼胞が全く形成されないことから、この胚における眼胞の形成に関わる遺伝子の発現をin situ hybridizationにより調べた。その結果、ホメオドメインを持つ転写制御因子であるRx,Six3の発現が、眼胞予定領域に於いて特異的に減少していることが明らかになった。現在、眼胞へ運命転換できなかった細胞の挙動について、発生段階ごとに観察を行っている。

LIM/同源结构域蛋白具有两个独特的结构域：具有锌指状结构的 LIM 结构域和同源结构域。 LIM/同源结构域蛋白的体外功能分析结果表明，LIM结构域抑制同源结构域与DNA结合的能力。因此，提出了一种模型，其中当LIM/同源结构域蛋白被激活时，另一个偶联因子被表达并且其与LIM结构域结合，从而释放LIM结构域对同源结构域的抑制作用。按照这个模型，我只过表达了斑马鱼胚胎中枢神经系统中特异表达的Islet-3的LIM结构域，并激活了内源性Islet-3的细胞内偶联因子。通过吸收来特异性抑制 Islet-3 的功能。结果，视泡/中脑-后脑边界（小脑原基）尚未完全形成，而Islet-3在视泡/中脑-后脑边界的形成中直接和间接地发挥着重要作用。他有。为了阐明 Islet-3 在视泡/中脑-后脑边界形成中的功能，我寻找了特异性结合 Islet-3 LIM 结构域的共轭因子。已知的利用蛋白质-蛋白质相互作用的遗传筛选方法包括利用酵母的酵母二杂交法和利用表达噬菌体文库的远西法。在双杂交系统中，很明显，该系统中的筛选很困难，因为酵母中的蛋白质与 Islet-3 的 LIM 结构域相互作用。 Far-western 使用 Islet-3 的 LIM 结构域和 GST 之间的融合蛋白作为探针，筛选了斑马鱼 22 至 26 小时胚胎表达 cDNA 文库的 120 万个克隆。结果，获得了 LANP（富含亮氨酸的酸性核蛋白）作为与 Islet-3 的 LIM 结构域特异性相互作用的核蛋白。据报道，该核蛋白在大鼠出生后小脑浦肯野细胞中表达，并且其表达随着小脑发育和回路形成的进展而增加。我们目前正处于分析阶段，以阐明 Islet-3/LANP 复合体在中脑-后脑边界形成中的作用。此外，由于在过表达Islet-3的LIM结构域的胚胎中没有形成视泡，因此我通过原位杂交研究了这些胚胎中参与视泡形成的基因的表达。结果表明，具有同源结构域的转录调节因子 Rx 和 Six3 的表达在预期视泡区域中特异性降低。目前，我们正在观察在每个发育阶段未能将命运转变为眼囊泡的细胞的行为。