N-グリコシル化糖蛋白質合成に関与する細胞周期依存的制御機構

N-糖基化糖蛋白合成中涉及的细胞周期依赖性控制机制

基本信息

批准号：
09780555
负责人：
福島慶子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Sasaki Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は同調したラット3Y1細胞を用いて、N-結合型糖鎖の生合成の制御について細胞周期依存性を含めた解析を行うことを目的としている。これまでに3Y1細胞の同調培養は接触阻止によりG_0期に移行するという性質を利用して行い、オリゴ糖・脂質中間体生成量及びその合成酵素活性量がG_1/S期に厳密に制御されていることを明らかにしてきた(J.Biochem.121,415-418,1997)。さらに、小胞体におけるオリゴ糖・脂質中間体合成のみならず、ゴルジ体に存在する糖転移酵体中でN-アセチルグルコサミン転移酵素I及びガラクトース転移酵素活性もまたG_1/S期に制御されていることを明らかにした。N-アセチルグルコサミン転移酵素Iについてはクローニングも為され、アミノ酸一次構造も判明していることから、リコンビナントを作製してポリクローナル抗体を得た。作製した抗体を用いてWestern blotting法により蛋白質発現レベルを調べたところ、酵素活性量と一致していることを確認した。さらに、接触阻止法による同調培養ではS期からG_2/M期に至っては同調が不十分に成らざるを得ないため、血清飢餓によりG_0期に移行した3Y1細胞をDNA合成阻害剤アフィジコリンを用いてG_1/S境界期に停止させ、G_2期、M期の詳細な解析を試みた。その結果、血清飢餓によるG_0状態の3Y1細胞は接触阻止によりG_0期に静止した3Y1細胞と異なり、オリゴ糖・脂質中間体合成量も各種酵素活性量も低下していないことが判明した。今後はN-結合型糖鎖合成開始のシグナルと接触阻止解除による増殖開始のシグナルとどのように関わりがあるのかを明らかにしていきたいと考えている。

本研究的目的是利用同步大鼠3Y1细胞来分析N联糖链生物合成的控制，包括细胞周期依赖性。迄今为止，3Y1细胞的同步培养是利用接触抑制向G_0期转变的特性进行的，并且严格控制G_1/G_1/期间产生的寡糖/脂质中间体的量及其合酶活性的量。 S 期（J.Biochem.121, 415-418, 1997）。此外，不仅内质网中寡糖和脂质中间体的合成，而且高尔基体中存在的糖基转移酶中的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I和半乳糖基转移酶的活性也在G_1/S期受到调节。由于N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I已被克隆并确定了一级氨基酸结构，因此制备了重组体并获得了多克隆抗体。当使用制备的抗体通过Western印迹检查蛋白质表达水平时，证实其与酶活性的量匹配。此外，使用接触抑制方法的同步培养不可避免地导致从S期到G_2/M期的同步性不足，因此通过血清饥饿已转变为G_0期的3Y1细胞使用DNA合成抑制剂阿菲迪霉素进行培养，我们在G_1/停止。 S边界周期并尝试对G_2和M周期进行详细分析。结果发现，由于血清饥饿而处于G_0期的3Y1细胞，寡糖/脂质中间体合成量或各种酶活性的量并没有减少，这与由于血清饥饿而处于G_0期静止的3Y1细胞不同。接触抑制。将来，我们希望阐明启动 N 连接糖链合成的信号与释放接触抑制后启动增殖的信号之间的关系。