高次元クロマチン損傷を対象としたヌクレオチド除去修復機構の分子基盤の解明

阐明针对高维染色质损伤的核苷酸切除修复机制的分子基础

基本信息

批准号：
22K18034
负责人：
松本翔太
金额：
$ 3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K18034/
关键词：
DNA修復ヌクレオチド除去修復 NER XPC TFIIH XPA ヌクレオソームクロマチン

项目摘要

ほ乳類のヌクレオチド除去修復（NER）は紫外線などによって生じたDNA損傷を取り除く、重要なDNA修復機構の一つである。ゲノム全体を対象としたNERでは、まずXPC複合体が損傷を認識することが必須であり、その後XPA、TFIIHをはじめとするNER因子群がリクルートされ、これらの働きにより損傷が切り出される。生化学的な実験により、詳細なNER機構の全容が明らかになりつつあるが、細胞内におけるNERについては不明な点が多く残されている。特筆すべきは生物のゲノムがとるクロマチン構造というユニークなDNA格納様式である。真核生物のゲノムDNAはヒストンタンパク質に高度に折り畳まれたクロマチン構造を構成することがわかっており、タンパク質がDNAへアクセスする際に空間的な制限を受けている。そのためヒストンフリーなDNAを基質として進めてきた生化学解析では、細胞内で起こるNERの全容を理解することが難しい。そこでクロマチン上の損傷に対するNERを理解することが期待されている。そこで研究代表者はクロマチン構造の最小単位であるヌクレオソームを試験管内で再構成することで、ヌクレオソーム上の損傷に対するNERを明らかにすることを目指した。まずDNAに紫外線損傷や損傷をミミックした構造体を化学合成し、これを元にヌクレオソームを再構成することで、ヌクレオソームの任意の位置に損傷をデザインする系を確立した。続いてNERタンパク質を試験管内再構成系に使用するため、NER因子であるXPC複合体、XPA、TFIIHをそれぞれ発現するバキュロウイルスシステムを構築した。これらを用いることにより、ヌクレオソーム上の任意の位置の損傷に対するNER機構を試験管内で再現することを目指した。

哺乳动物核苷酸切除修复（NER）是一种重要的DNA修复机制，可以消除紫外线造成的DNA损伤。在针对整个基因组的NER中，XPC复合物首先识别损伤至关重要，然后招募包括XPA和TFIIH在内的一组NER因子，并通过它们的作用切除损伤。尽管生化实验已开始揭示 NER 机制的全部细节，但细胞内 NER 的许多方面仍不清楚。值得注意的是生物体基因组采用的染色质结构的独特DNA存储格式。已知真核基因组 DNA 由高度折叠的染色质结构组成，该结构由组蛋白组成，并且蛋白质对 DNA 的访问在空间上受到限制。因此，使用无组蛋白 DNA 作为底物进行的生化分析使得很难了解细胞内发生的 NER 的全部范围。因此，人们期望了解 NER 对染色质损伤的反应。因此，主要研究人员旨在通过在体外重建核小体（染色质结构的最小单位）来阐明 NER 对核小体损伤的作用。首先，他们化学合成了一种模拟紫外线损伤或DNA损伤的结构，然后在此基础上重构核小体，从而建立了一个在核小体上任意位置设计损伤的系统。接下来，为了在体外重建系统中使用NER蛋白，我们构建了表达NER因子XPC复合物、XPA和TFIIH的杆状病毒系统。通过使用这些，我们的目的是在体外重现核小体任意位置损伤的 NER 机制。