転写因子FoxO1/PPARαを用いた選択的インスリン抵抗性の病態解明

使用转录因子 FoxO1/PPARα 阐明选择性胰岛素抵抗的病理学

基本信息

批准号：
22K16422
负责人：
北本匠
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16422/
关键词：
糖尿病インスリン抵抗性 Foxo1 2型糖尿病糖産生 FoxO1 PPARα

项目摘要

本年度に打ち立てた目標は主にFoxO1とPPRAαの相互作用を明らかにすることである。まずFoxO1とPPARαの発現プラスミドを作成した。PPARαに対する良質な抗体が生産中止により入手できなくなってしまったため、N末端にDDK (Flag)を付着させ、FoxO1にはHAを付着させて作成した。ウェスタンブロットにより、これらのプラスミドのタンパク発現が各々の転写因子の分子量に相当する52kDaおよび80kDaにブロットされることを確認し、Luciferaseアッセイへと進めた。まず肝糖新生の律速酵素をコードする主要な制御遺伝子であるG6pcについて、先行研究で行ったFoxo1とPPARαのChIP-seqのデータから、両者が結合するPromoterおよびEnhancer領域を同定した。それらの配列を用いて、1) Promoter-pGL4.10, 2) Enhancer-pGL4.10, 3) Enhancer-Promoter-pGL4.10の3種類のLuciferase assay用プラスミドを作成した。これらに対して、各々のリガンドであるインスリン、遊離脂肪酸、WY14643の3種類を用いて刺激を行い、G6pcの発現変化を評価した。その結果、FoxO1とPPARαはG6pcの発現を相乗的に強めることが確認された。この効果はEnhancerのみでは認められず、EnhancerとPromoterが揃わなければ得られなかった。また、これらの実験とは別に、FoxO1とPPARαのダブルノックアウトマウスから肝臓組織を取得し、適切な条件を評価した上で、それらのサンプルをRNA-seqに回して、現在解析をしている最中である。次年度の目標である糖代謝特異的標的遺伝子群の同定に向けて着実に研究を進めている。

我们今年的主要目标是阐明 FoxO1 和 PPRAα 之间的相互作用。首先，我们创建了 FoxO1 和 PPARα 的表达质粒。由于PPARα的高质量抗体因停产而不再可用，因此它是通过将DDK（Flag）连接到N末端并将HA连接到FoxO1来创建的。通过Western blotting证实这些质粒的蛋白表达被印迹到52 kDa和80 kDa，这对应于每个转录因子的分子量，并且我们进行荧光素酶测定。首先，对于编码肝糖异生限速酶的主要调控基因G6pc，我们根据之前研究中进行的Foxo1和PPARα的ChIP-seq数据，鉴定了与Foxo1和PPARα结合的启动子和增强子区域。使用这些序列，创建了用于荧光素酶测定的三种类型的质粒：1)启动子-pGL4.10、2)增强子-pGL4.10和3)增强子-启动子-pGL4.10。这些细胞受到三种配体的刺激：胰岛素、游离脂肪酸和 WY14643，并评估了 G6pc 表达的变化。结果证实FoxO1和PPARα协同增强G6pc表达。这种效果单靠Enhancer是无法达到的，需要Enhancer和Promoter配合才能达到。除了这些实验之外，我们还获取了 FoxO1 和 PPARα 双敲除小鼠的肝组织，评估了适当的条件，然后将这些样本提交给 RNA-seq，目前正在分析中。我们正在稳步推进研究，以实现明年确定糖代谢特异性靶基因的目标。