診断困難であった性感染症原因菌の同定と抗菌薬耐性の同時迅速検査法

同时快速检测方法，鉴定一直难以诊断的性传播疾病致病菌和抗菌药物耐药性

基本信息

批准号：
22K16376
负责人：
酒井純
金额：
$ 2.08万
依托单位：
Saitama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、薬剤耐性に寄与する各ゲノム上の一塩基変異(SNP)を明瞭に区別しつつ、同時に尿路感染症の起因菌を推定できるMultiplex-PCR増幅系(多項目同時検査)を構築することが目的である。当該年度は、尿路感染症としても頻度の高い淋菌(Neisseria gonorrhoeae)のDNAを鋳型として、淋菌の同定と同菌のフルオロキノロン耐性を引き起こす主原因、gyrA遺伝子上のSNP変異を同時に測定できる検出系を設計した。方法としてDNA精製後検体を外部注文し、作成する新規検出系の精度を判定するために使用した。また、Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp)を用いて淋菌の検出を可能にするプライマーを設計し、NgS primerとして外部業者に注文した。また、ゲノム・データベースからgyrA遺伝子における保存領域を明らかにし、Primer Explorer V5を用いて候補プライマーの設計を同様に行った。プライマー設計後、SNPのない配列に対してのみ特異的結合を示すLocked Nucleic Acid (LNA)をプライマー中に組み込み、フルオロキノロン感受性株(SNPなし)のみに反応するgyrAプライマーを作成し、同時に検出できるか確認した。結果として淋菌全5株(100%)でNgS primersで遺伝子増幅を認めた。一方、淋菌以外で尿路感染症を引き起こしうる、またはコンタミネーションで検出しうる非淋菌性微生物では反応が見られなかったことから、本プライマーの特異度が良好であると判断された。同時にgyrA野生株では、gyrAプライマーで反応が見られた一方、他SNP変異のある変異株では反応が見られず、本検出系は淋菌とそのフルオロキノロン耐性の有無を同時検出することが可能と考えられた。

这项研究的目的是清楚区分每个有助于耐药性的基因组上的单核苷酸突变（SNP），同时建立了一个可以同时估计由尿尿道感染引起的细菌的多重PCR扩增系统（多项目同时测试）。在今年，我们设计了一个检测系统，该系统可以同时测量Gyra基因上的SNP突变，Gyra基因是淋病鉴定的主要原因，这也是一种频繁的尿路感染。作为一种方法，DNA纯化之后是样品的外部排序，并用于确定要创建的新检测系统的准确性。此外，使用Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp）设计了能够检测淋病的底漆，并从外部公司订购作为NGS底漆。此外，从基因组数据库中揭示了Gyra基因中的保守区域，并使用引物资源管理器V5以相同的方式设计了候选引物。底漆设计后，将仅与没有SNP的序列具有特异性结合的锁定核酸（LNA）掺入了引物中，并且仅对氟喹诺酮敏感性菌株（无SNP）响应的Gyra底漆创建了是否可以同时检测到它们。结果，在所有五种淋病菌株（100％）的NGS引物中观察到基因扩增。另一方面，在非群局微生物中未观察到可能引起淋球菌以外的其他尿路感染或可以通过污染检测到的反应，因此确定该引物的特异性是良好的。同时，在Gyra野生菌株中观察到与Gyra底漆的反应，而与其他具有SNP突变的突变体没有反应，并且该检测系统被认为能够同时检测出淋病的存在或不存在。