診断困難であった性感染症原因菌の同定と抗菌薬耐性の同時迅速検査法

同时快速检测方法，鉴定一直难以诊断的性传播疾病致病菌和抗菌药物耐药性

基本信息

批准号：
22K16376
负责人：
酒井純
金额：
$ 2.08万
依托单位：
Saitama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、薬剤耐性に寄与する各ゲノム上の一塩基変異(SNP)を明瞭に区別しつつ、同時に尿路感染症の起因菌を推定できるMultiplex-PCR増幅系(多項目同時検査)を構築することが目的である。当該年度は、尿路感染症としても頻度の高い淋菌(Neisseria gonorrhoeae)のDNAを鋳型として、淋菌の同定と同菌のフルオロキノロン耐性を引き起こす主原因、gyrA遺伝子上のSNP変異を同時に測定できる検出系を設計した。方法としてDNA精製後検体を外部注文し、作成する新規検出系の精度を判定するために使用した。また、Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp)を用いて淋菌の検出を可能にするプライマーを設計し、NgS primerとして外部業者に注文した。また、ゲノム・データベースからgyrA遺伝子における保存領域を明らかにし、Primer Explorer V5を用いて候補プライマーの設計を同様に行った。プライマー設計後、SNPのない配列に対してのみ特異的結合を示すLocked Nucleic Acid (LNA)をプライマー中に組み込み、フルオロキノロン感受性株(SNPなし)のみに反応するgyrAプライマーを作成し、同時に検出できるか確認した。結果として淋菌全5株(100%)でNgS primersで遺伝子増幅を認めた。一方、淋菌以外で尿路感染症を引き起こしうる、またはコンタミネーションで検出しうる非淋菌性微生物では反応が見られなかったことから、本プライマーの特異度が良好であると判断された。同時にgyrA野生株では、gyrAプライマーで反応が見られた一方、他SNP変異のある変異株では反応が見られず、本検出系は淋菌とそのフルオロキノロン耐性の有無を同時検出することが可能と考えられた。

在本研究中，我们构建了一个多重PCR扩增系统（多项目同时测试），可以清楚地区分每个基因组上导致耐药性的单核苷酸变异（SNP），同时估计尿路感染的致病菌目的是。本财年，我们将使用常见尿路感染淋病奈瑟菌的DNA作为模板，同时识别淋病奈瑟菌并检测gyrA基因中的SNP突变，设计了该细菌中氟喹诺酮类耐药的主要原因。系统。作为一种方法，DNA 纯化后的样品从外部订购并用于确定正在创建的新检测系统的准确性。此外，我们还设计了一种能够使用 Primer Explorer V5 (http://primerexplorer.jp) 检测淋病奈瑟菌的引物，并从外部供应商订购了 NgS 引物。此外，从基因组数据库中鉴定了gyrA基因中的保守区域，并使用Primer Explorer V5类似地设计了候选引物。引物设计后，仅与不含 SNP 的序列特异性结合的锁定核酸 (LNA) 被整合到引物中，以创建仅与氟喹诺酮敏感菌株（不含 SNP）反应的 gyrA 引物，从而允许同时检测。结果，使用 NgS 引物在所有 5 种淋病奈瑟菌菌株（100%）中观察到基因扩增。另一方面，由于没有观察到与可引起尿路感染或可被检测为污染的淋球菌以外的非淋球菌微生物的反应，因此判断该引物的特异性良好。同时，在gyrA野生株中观察到与gyrA引物有反应，而在具有其他SNP突变的突变株中未观察到反应，表明该检测系统可以同时检测淋病奈瑟菌及其致病菌的存在与否。据认为，氟喹诺酮类药物耐药。