創薬基盤となる脂質によるイオンチャネル活性・動態調節機構の統括的理解

全面了解离子通道活性和脂质的动力学调节机制，这是药物发现的基础

基本信息

批准号：
22K15373
负责人：
好岡大輔
金额：
$ 3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、イノシトールリン脂質PIP2による電位依存性カリウムチャネル制御について、活性制御と動態制御の両面から解析し、両者の相関関係を明らかにすること目指している。まず、既報を参考にして選定したKCNQ3のPIP2作用部位に変異導入した変異体を多数作成し、海馬ニューロンにおけるイオンチャネルの空間動態を共焦点および１分子イメージング解析した。その結果、変異型KCNQ3は細胞体や樹状突起と比較してAISに対して優先的に輸送されるものの、その細胞表面発現量は野生型と比較して有意に減少することが分かった。また、そのトラフィッキング効率の低下は変異体のイオンチャネル活性（電流密度）に相関していた。さらに、これら変異型KCNQ3を野生型KCNQ2と共発現させると、野生型KCNQ2のトラフィッキングを阻害することも確認できた。次に、１分子イメージングによって変異型KCNQ3の空間動態をより詳細に解析し、３次元的な空間動態のどの過程に変化が生じているのか調べた。その結果、まずKCNQ3の側方拡散動態は拡散係数の異なる３種類の状態に分類でき、変異型KCNQ3では遅い拡散状態の割合が10%程度有意に減少し、逆に速い拡散状態の割合が10%程度増加することが判明した。最後に、ケージドリジン系を確立するためにKCNQ3(K260TAG)変異体を作成した。本年度はこの変異体のPIP2親和性を光操作するまでは至らなかったが、合成ケージドリジンがKCNQ3(K260TAG)変異体へ正常に組み込まれることまでは蛍光イメージングと全細胞パッチクランプにより確認できた。

在本研究中，我们旨在从活性控制和动态控制两个方面分析肌醇磷脂PIP2对电压门控钾通道的调节，并阐明两者之间的相关性。首先，我们根据之前的报道创建了多个突变体，其中选择了KCNQ3的PIP2作用位点，并使用共聚焦和单分子成像分析了海马神经元离子通道的空间动态。结果显示，虽然相比于细胞体和树突，突变体KCNQ3优先转运至AIS，但与野生型相比，其细胞表面表达水平显着降低。此外，运输效率的降低与突变体的离子通道活性（电流密度）相关。此外，还证实当这些突变体KCNQ3与野生型KCNQ2共表达时，它们抑制野生型KCNQ2的运输。接下来，我们利用单分子成像更详细地分析了突变体KCNQ3的空间动力学，并研究了三维空间动力学中的哪些过程正在发生变化。结果，KCNQ3的横向扩散动力学可分为三种不同扩散系数的状态，并且在突变体KCNQ3中，慢扩散状态的比例显着下降约10%，相反，快扩散状态的比例显着下降。状态下降了10%左右。最后，我们创建了 KCNQ3 (K260TAG) 突变体来建立笼式赖氨酸系统。尽管我们今年无法对该突变体的 PIP2 亲和力进行光操作，但我们能够使用荧光成像和全细胞膜片钳确认合成的笼养赖氨酸成功掺入 KCNQ3 (K260TAG) 突变体中。