Screening of receptors relating to cellular uptake of antibody-drug conjugate aggregates

筛选与细胞摄取抗体-药物缀合物聚集体相关的受体

• 批准号: 22K15301
• 负责人: 青山 道彦
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: National Institute of Health Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15301/
• 关键词: 抗体凝集体; 細胞内取込; 受容体; CRISPR-Cas9 screening; 抗体薬物複合体; 凝集体; genome wide screening

抗体受容体として知られるFcγ受容体（FcγR）による細胞内取込では説明しきれない抗体凝集体の細胞内取込のメカニズム解明を図るべく、抗体凝集体の細胞内取込に寄与するFcγR以外の受容体の同定に向け、Genome-wide CRISPR-Cas9 screening systemの構築ならびにスクリーニングを試みた。これまでに抗体の凝集によりFcγR非依存的な細胞内への移行量の増強が認められた細胞株に関して、蛍光標識抗体ならびにその凝集体を添加し、フローサイトメトリーにより細胞内蛍光強度を評価した。その結果、単量体の蛍光標識抗体では抗体濃度依存的に細胞内蛍光強度が増加したのに対し、凝集体添加群では一部の細胞において、低濃度作用時から非常に高い蛍光強度が認められた。そこで、本細胞株を基にCas9発現細胞株を作成し、さらにCRISPR knockout libraryをレンチウイルスで導入、薬剤選別によりGenome-wide CRISPR-Cas9 KO library systemを構築した。なお、作成したCas9発現細胞株ならびにsgRNAを発現したpooled libraryにおいても、抗体凝集体の非常に高い細胞内移行が認められた。次に、pooled libraryに蛍光標識抗体凝集体を添加し、抗体凝集体の細胞内取込が認められない画分のみをセルソーターで回収⇒細胞培養のサイクルを繰り返し、sgRNAにより抗体凝集体の取込が抑制された細胞の選別を実施した。スクリーニングの前後におけるsgRNAの発現変動をNGS解析により評価した。NGS解析の結果、抗体凝集体の細胞内取込に関与している可能性のある候補分子が複数同定されたことから、今後、同定された候補分子の抗体凝集体の細胞内取込における寄与を検証する予定である。

为了阐明无法通过被称为抗体受体的 Fcγ 受体（FcγR）的细胞内摄取来解释的抗体聚集体的细胞内摄取的机制，我们研究了 FcγR 以外的有助于抗体聚集体的细胞内摄取的机制。尝试构建和筛选全基因组CRISPR-Cas9筛选系统来鉴定CRISPR-Cas9的受体。对于由于抗体聚集而观察到不依赖于FcγR的细胞内迁移量增强的细胞系，添加荧光标记的抗体及其聚集体，并通过流式细胞术评价细胞内荧光强度。结果，细胞内的荧光强度根据单体荧光标记抗体的抗体浓度而增加，而在聚集体添加组中，即使在低浓度下，在一些细胞中也观察到极高的荧光强度。因此，我们在此细胞系的基础上创建了Cas9表达细胞系，并利用慢病毒引入了CRISPR敲除文库，并通过药物筛选构建了全基因组CRISPR-Cas9 KO文库系统。此外，在创建的表达 Cas9 的细胞系和表达 sgRNA 的混合文库中，观察到抗体聚集体的细胞内转移非常高。接下来，将荧光标记的抗体聚集体添加到混合文库中，仅收集使用细胞分选仪观察到细胞内未观察到抗体聚集体的部分⇒重复细胞培养周期，并使用 sgRNA 掺入抗体聚集体我们进行了细胞选择。其中表达被抑制。通过NGS分析评估筛选前后sgRNA表达的变化。 NGS分析的结果是，鉴定出了多个可能参与抗体聚集体细胞内摄取的候选分子。未来，我们将研究所鉴定的候选分子对抗体聚集体细胞内摄取的贡献，我们计划进行验证。这。