Characterizing the roles of oocyte-specific factors in inhibiting unique features of the sperm epigenome

描述卵母细胞特异性因子在抑制精子表观基因组独特特征中的作用

• 批准号: 22K15125
• 负责人: 白根 健次郎
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15125/
• 关键词: 卵母細胞; 発生能獲得; エピゲノム; 転写因子ネットワーク; 体外再構築系

雌雄の配偶子は異なるゲノム機能をもち、接合により相互補完されることにより発生能（全能性）を獲得する。本研究では、ゲノム機能制御の代表例である配偶子のエピゲノム（特にDNAメチル化）制御に着目する。具体的には、①卵母細胞エピゲノムの雄性化を抑制する卵母細胞因子の同定と②その因子の発現制御機構の解明を目指す。初年度は、①の達成を目指し、以下の2項目を実施した。（1）卵母細胞因子を欠損するマウスES細胞の作出とそのES細胞を起点とした卵母細胞の誘導（後述の卵巣の体外再構築系を利用）と（2）因子欠損型の卵母細胞における全ゲノムDNAメチル化地図の作成である。（1）CRISPR/Cas9法により、卵母細胞因子の発現制御領域を欠損させたES細胞を作出した。このES細胞を起点として、エピブラスト様細胞を誘導したのちに、始原生殖細胞様の細胞へと分化させた。セルソーターにより分取した始原生殖細胞様の細胞を胎齢12.5日胚の卵巣体細胞と凝集させたのちに、気相液相培養を行い、体外で卵巣を構築した。この体外再構築卵巣から二次卵母細胞を採取し、定量PCR法により卵母細胞因子の発現消失を確認した。（2）酵素反応をベースとするDNAメチル化解析手法のEM-seq（Enzymatic Methyl-seq）法を微量細胞へと最適化したのちに全ゲノムDNAメチル化解析に着手した。野生型、因子欠損型の二次卵母細胞からEM-seq法によりライブラリーを調製し、全ゲノムDNAメチル化地図を作成した。現在、欠損型においてDNAメチル化変化領域の抽出を進めている。最後に、本研究で取り上げている生殖細胞の発生とエピゲノム動態の現状のまとめと展望についての総説を発表した（Shirane, 2022）。

雄性和雌性配子具有不同的基因组功能，并通过接合互补而获得发育潜力（全能性）。在本研究中，我们重点关注配子表观基因组（特别是DNA甲基化）的控制，这是基因组功能控制的典型例子。具体来说，我们的目标是（1）识别抑制卵母细胞表观基因组男性化的卵母细胞因子，以及（2）阐明这些因子的表达控制机制。第一年，我们以实现①为目标，实施了以下两项措施。 (1) 产生缺乏卵母细胞因子的小鼠 ES 细胞，并从这些 ES 细胞诱导卵母细胞（使用下述体外卵巢重建系统）；以及 (2) 缺乏因子的卵母细胞。细胞中的甲基化图谱。 (1)利用CRISPR/Cas9方法，我们创建了删除了卵母细胞因子表达控制区的ES细胞。使用这些ES细胞作为起点，诱导外胚层样细胞，然后分化为原始生殖细胞样细胞。使用细胞分选仪分选的原始生殖细胞样细胞与12.5天龄胚胎的卵巢体细胞聚集，然后进行气液相培养以在体外构建卵巢。从该体外重建的卵巢中收集次级卵母细胞，并通过定量PCR证实卵母细胞因子表达的丧失。 （2）将基于酶促反应的DNA甲基化分析方法EM-seq（Enzymatic Mmethyl-seq）优化用于少量细胞后，我们开始进行全基因组DNA甲基化分析。使用 EM-seq 方法从野生型和因子缺陷型次级卵母细胞中制备文库，并创建全基因组 DNA 甲基化图谱。目前，我们正在提取缺陷型中发生DNA甲基化变化的区域。最后，我们提出了一篇综述文章，总结了本研究涵盖的生殖细胞发育和表观基因组动力学的现状和前景（Shirane，2022）。