Characterizing the roles of oocyte-specific factors in inhibiting unique features of the sperm epigenome

描述卵母细胞特异性因子在抑制精子表观基因组独特特征中的作用

• 批准号: 22K15125
• 负责人: 白根 健次郎
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15125/
• 关键词: 卵母細胞; 発生能獲得; エピゲノム; 転写因子ネットワーク; 体外再構築系

雌雄の配偶子は異なるゲノム機能をもち、接合により相互補完されることにより発生能（全能性）を獲得する。本研究では、ゲノム機能制御の代表例である配偶子のエピゲノム（特にDNAメチル化）制御に着目する。具体的には、①卵母細胞エピゲノムの雄性化を抑制する卵母細胞因子の同定と②その因子の発現制御機構の解明を目指す。初年度は、①の達成を目指し、以下の2項目を実施した。（1）卵母細胞因子を欠損するマウスES細胞の作出とそのES細胞を起点とした卵母細胞の誘導（後述の卵巣の体外再構築系を利用）と（2）因子欠損型の卵母細胞における全ゲノムDNAメチル化地図の作成である。（1）CRISPR/Cas9法により、卵母細胞因子の発現制御領域を欠損させたES細胞を作出した。このES細胞を起点として、エピブラスト様細胞を誘導したのちに、始原生殖細胞様の細胞へと分化させた。セルソーターにより分取した始原生殖細胞様の細胞を胎齢12.5日胚の卵巣体細胞と凝集させたのちに、気相液相培養を行い、体外で卵巣を構築した。この体外再構築卵巣から二次卵母細胞を採取し、定量PCR法により卵母細胞因子の発現消失を確認した。（2）酵素反応をベースとするDNAメチル化解析手法のEM-seq（Enzymatic Methyl-seq）法を微量細胞へと最適化したのちに全ゲノムDNAメチル化解析に着手した。野生型、因子欠損型の二次卵母細胞からEM-seq法によりライブラリーを調製し、全ゲノムDNAメチル化地図を作成した。現在、欠損型においてDNAメチル化変化領域の抽出を進めている。最後に、本研究で取り上げている生殖細胞の発生とエピゲノム動態の現状のまとめと展望についての総説を発表した（Shirane, 2022）。

男性和女配子具有不同的基因组功能，并通过结合以获得发育潜力（Tomnipotency）进行补充。这项研究的重点是对配子表观组（尤其是DNA甲基化）的控制，这是基因组功能控制的代表性例子。具体而言，我们的目的是1）识别抑制卵母细胞表观基因组的气化的卵母细胞因子，以及2）阐明这些因素的表达控制机制。在第一年，实施了以下两个项目，目的是实现①。 （1）创建卵母细胞因子缺陷的小鼠ES细胞，诱导源自这些ES细胞的卵母细胞（使用下面描述的卵巢的体外重建系统）以及（2）创建缺乏因子缺陷型卵母细胞中全基因组DNA甲基化图。 （1）通过CRISPR/CAS9方法缺乏卵母细胞因子表达控制区域产生ES细胞。从这些ES细胞开始，诱导了其中音细胞样细胞，然后分化为原始细菌样细胞。在12.5天的胎龄上与胚胎的卵巢体细胞汇总，与细胞分类器分离的原始细菌样细胞聚集，其次是气相液相培养物，以在体外构造卵巢。从体外重建的卵巢中收集次生卵母细胞，并通过定量PCR确认卵母细胞因子表达的消失。 （2）在优化基于酶的DNA甲基化分析方法的EM-Seq（酶甲基seq）方法中，我们开始分析整个基因组DNA甲基化。通过EM-SEQ方法从野生型，缺乏因子的二次卵母细胞制备文库，以生成全基因组DNA甲基化图。目前，我们目前正在以缺失形式扩展DNA甲基化改变区域。最后，我们发表了对本研究中讨论的生殖细胞发育和表观基因组动力学的当前状态和前景的回顾（Shirane，2022）。