A direct evolution method and a rational design strategy for synthetic mRNAs that control mammalian cell fate

控制哺乳动物细胞命运的合成mRNA的直接进化方法和合理设计策略

基本信息

批准号：
22K15090
负责人：
川崎俊輔
金额：
$ 3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

RNAの持つ遺伝子発現制御能や分子結合能といった機能に着目し、タンパク質翻訳を標的分子依存的に誘発できる人工mRNAの作出が試みられている。このような、「ON型」の人工mRNAは、単純な分子検出のみならず、導入遺伝子を介して細胞機能をも制御できるため非常に有用である。しかしながら、哺乳類細胞内で機能するON型mRNAを簡便かつ迅速に開発することは未だ挑戦的である。そこで、本研究では、申請者の最近の発見に立脚し、 ON型mRNAを創出できるハイスループット分子進化技術および合理的設計方法を確立する。本年度は計画に従い、「新規人工RNA配列の取得が可能なハイスループット指向性進化法の確立」を目指した。そのために、利用する酵素、及び各反応ステップの条件の検討と最適化を実施した。また、「計算機を用いた核酸相互作用予測に基づく新規人工mRNAの合理的設計法の確立」のために、選定したRNA構造のin vitroでの機能評価を行った。この結果、選定したRNA構造は、意図した機能をin vitro条件下でも有していたものの、その性能は、以降の実験には不十分であることが示唆された。これらに加えて、ON型mRNAの設計最適化を進めた。DNA導入におけるON型mRNAの発現方法、RNA導入におけるON型mRNAの調整方法の検討を行った。これらの成果は、2022年度分子生物学会年会他にて報告済みである。今後は、指向性進化実験を実施するとともに、合理的設計法の確立を目指す。また、並行して、哺乳類細胞導入によって細胞運命制御を達成するために最適なON型mRNAの発現、導入、調整方法を探索する。その後、モデル実験によって細胞運命制御の達成可能性を検討する。

为了产生可以以靶分子依赖性方式诱导蛋白质翻译的人工mRNA，重点是RNA的功能，例如基因表达控制和分子结合能力。这种“类型”人工mRNA非常有用，因为它们不仅可以检测分子，而且可以通过转基因调节细胞功能。但是，以简单而快速的方式开发在哺乳动物细胞中起作用的型上mRNA仍然具有挑战性。因此，这项研究将基于申请人的最新发现，建立高通量分子进化技术和合理的设计方法，这些方法可以生成类型的mRNA。今年，根据计划，我们旨在“建立一种高通量定向进化方法，允许获取新的人工RNA序列”。为此，检查和优化了要使用的酶和每个反应步骤的条件。此外，为了“基于使用计算机对核酸相互作用的预测进行新型人工mRNA的合理设计方法”，我们对体外选定的RNA结构进行了功能评估。这表明，尽管所选的RNA结构即使在体外条件下也具有预期功能，但它们的性能不足以进行随后的实验。除此之外，我们还一直在研究型MRNA的设计优化。我们研究了在DNA转移过程中类型mRNA的表达方法和在RNA转移过程中的调控方法。这些结果已在分子生物学学会和其他人学会的2022年会上报道。将来，我们将实施定向进化实验，并旨在建立合理的设计方法。同时，我们还将探讨通过哺乳动物细胞引入来控制细胞命运的最佳表达，引入和调节，以实现细胞命运。然后通过模型实验检查细胞命运控制的可实现性。