SunTag法による脂肪細胞種固有の分化決定因子のエピゲノム制御への挑戦

使用 SunTag 方法挑战脂肪细胞类型特异性分化因子的表观基因组控制

基本信息

批准号：
22K15081
负责人：
鈴木智大
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

2022年度は、計画①「aP2レポーター遺伝子およびSunTag-SETDB1発現細胞の作製」、および、計画②「SunTag-SETDB1によるH3K9me3を介した標的遺伝子の発現制御」の確認を予定していた。計画①では、白色脂肪前駆細胞 (3T3-L1細胞) のレポーター細胞株の樹立を試みた。網羅的遺伝子発現解析により、aP2 (Fabp4) 発現は脂肪細胞分化の比較的初期から増加することがわかっていたため、レポーターとしてはaP2プロモーターの下流にGFPを配置した配列 (paP2-GFP) を利用することとした。樹立に際し、paP2-GFPを導入したpiggyBacプラスミドを作製し，トランスポゼースプラスミドと共に4D-Nucleofectorで導入して脂肪前駆細胞に安定発現させた後、薬剤選択によってレポーター配列が導入された細胞を選別した。得られた安定発現株を脂肪細胞分化させてGFP蛍光を経時的に観察したところ、GFP蛍光は分化開始4日後から明確に確認され、分化開始8日後でも観察された。したがって、当初の目的通りレポーター細胞株の樹立に成功した。一方、細胞間でGFP蛍光にばらつきが認められたため、当初の予定を変更し、レポーター細胞をクローニングすることとした。現在、クローニング細胞を19ライン樹立し、優良な細胞株を選定中である。計画②に関しては、本年度は実施を見送り来年度に行うこととした。

2022财年，我们计划确认计划1：“创建aP2报告基因和SunTag-SETDB1表达细胞”和计划2：“SunTag-SETDB1通过H3K9me3控制靶基因表达”。在计划1中，我们尝试建立白色前脂肪细胞（3T3-L1细胞）的报告细胞系。综合基因表达分析表明，aP2 (Fabp4) 表达从脂肪细胞分化的相对早期阶段开始增加，因此我们决定使用位于 aP2 启动子下游的 GFP 阵列 (paP2-GFP) 作为报告基因。为了建立，使用4D-Nucleofector制作含有paP2-GFP的piggyBac质粒，并与转座酶质粒一起导入，使其在前脂肪细胞中稳定表达，并通过药物选择来选择已导入报告序列的细胞。当获得的稳定表达系分化成脂肪细胞并随时间观察GFP荧光时，在分化开始后4天清楚地观察到GFP荧光，甚至在分化开始后8天也观察到GFP荧光。因此，我们按照最初的计划成功建立了报告细胞系。另一方面，由于观察到细胞之间 GFP 荧光的差异，他们改变了原来的计划，决定克隆报告细胞。目前已建立19个克隆细胞系，正在筛选优良细胞系。关于方案二，我们决定今年推迟实施，明年实施。