バクテリアコンデンシンMukB同士の会合を介した染色体凝縮機構

细菌凝缩蛋白 MukB 联合介导的染色体凝缩机制

• 批准号: 22K15086
• 负责人: 秋山 光市郎
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15086/
• 关键词: バクテリアコンデンシン; MukBEF; 染色体; 大腸菌; 部位特異的光架橋; 染色体凝縮; タンパク質間相互作用; rDNA

本研究では、(A)一本鎖DNAに結合したMukBEF複合体によるDNA凝縮の検出、(B)一本鎖DNA結合後のMukBの構造状態の解析、の2つの実験を通して、一本鎖DNA領域に結合したMukBがDNAを凝縮する分子機構の解明を目指す。(A)(B)のいずれにおいても大腸菌の細胞を用いた実験と精製タンパク質を用いた生化学実験をそれぞれ実施し、in vivo とin vitroの両面からアプローチする。2022年度は特に(B)の実験を中心に研究を実施した。(B)の実験では、MukBによるDNA凝縮が「一本鎖DNA結合」→（MukBの構造変化）→「MukFとの相互作用」→「DNA凝縮」という過程を辿るという仮説を立て、一本鎖DNA結合の有無がMukBとMukFの相互作用に及ぼす影響を比較することでこれを検証する。まず、MukBとMukFの相互作用及びMukBダイマーの分子内相互作用を検出し、それらの相互作用が一本鎖DNAの有無や一本鎖DNA結合を低下させるMukB変異によって変化する様子を調べることでMukBの構造状態を解析しようと試みた。相互作用の検出は、アミノ酸残基レベルの分解能でタンパク質間相互作用を検出可能な部位特異的光架橋法を採用した。部位特異的光架橋実験に必要なMukB変異体及びMukF変異体を作製し華僑実験を実施したが、目的としたタンパク質間相互作用の検出には至っていない。また、一本鎖DNA結合によりMukBの構造が変化するという仮説は、一本鎖DNA結合が低下したMukB変異体の分子内サプレッサー変異解析が一つの根拠となっている。2022年度はサプレッサー解析の実施を継続し、この仮説の基盤をより確かなものとした。

在本研究中，我们通过两个实验研究了如何检测单链 DNA：(A) 检测与单链 DNA 结合的 MukBEF 复合物的 DNA 缩合，以及 (B) 分析与单链 DNA 结合后 MukB 的结构状态。我们的目标是阐明 MukB 与该区域结合并浓缩 DNA 的分子机制。在（A）和（B）中，将进行使用大肠杆菌细胞的实验和使用纯化蛋白质的生化实验，并且将采用体内和体外方法。 2022 财年，重点开展了实验 (B) 的研究。在实验（B）中，我们假设MukB的DNA缩合遵循“单链DNA结合”→（MukB的结构变化）→“与MukF相互作用”→“DNA缩合”的过程，我们通过比较效果来验证这一点。链 DNA 结合的存在或不存在对 MukB 和 MukF 之间相互作用的影响。首先，我们检测了 MukB 和 MukF 之间的相互作用以及 MukB 二聚体的分子内相互作用，并研究了这些相互作用如何根据单链 DNA 的存在或不存在以及减少单链 DNA 结合的 MukB 突变而变化。分析 MukB 的结构状态。为了检测相互作用，我们采用了位点特异性光交联方法，可以在氨基酸残基水平上以分辨率检测蛋白质-蛋白质相互作用。尽管我们创建了位点特异性光交联实验所需的 MukB 和 MukF 突变体，并进行了海外中国实验，但我们无法检测到所需的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，MukB 结构因单链 DNA 结合而改变这一假设的基础之一是对单链 DNA 结合减少的 MukB 突变体中分子内抑制突变的分析。 2022年，我们将继续进行抑制分析，以进一步巩固这一假设的基础。