バクテリアコンデンシンMukB同士の会合を介した染色体凝縮機構

细菌凝缩蛋白 MukB 联合介导的染色体凝缩机制

• 批准号: 22K15086
• 负责人: 秋山 光市郎
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15086/
• 关键词: バクテリアコンデンシン; MukBEF; 染色体; 大腸菌; 部位特異的光架橋; 染色体凝縮; タンパク質間相互作用; rDNA

本研究では、(A)一本鎖DNAに結合したMukBEF複合体によるDNA凝縮の検出、(B)一本鎖DNA結合後のMukBの構造状態の解析、の2つの実験を通して、一本鎖DNA領域に結合したMukBがDNAを凝縮する分子機構の解明を目指す。(A)(B)のいずれにおいても大腸菌の細胞を用いた実験と精製タンパク質を用いた生化学実験をそれぞれ実施し、in vivo とin vitroの両面からアプローチする。2022年度は特に(B)の実験を中心に研究を実施した。(B)の実験では、MukBによるDNA凝縮が「一本鎖DNA結合」→（MukBの構造変化）→「MukFとの相互作用」→「DNA凝縮」という過程を辿るという仮説を立て、一本鎖DNA結合の有無がMukBとMukFの相互作用に及ぼす影響を比較することでこれを検証する。まず、MukBとMukFの相互作用及びMukBダイマーの分子内相互作用を検出し、それらの相互作用が一本鎖DNAの有無や一本鎖DNA結合を低下させるMukB変異によって変化する様子を調べることでMukBの構造状態を解析しようと試みた。相互作用の検出は、アミノ酸残基レベルの分解能でタンパク質間相互作用を検出可能な部位特異的光架橋法を採用した。部位特異的光架橋実験に必要なMukB変異体及びMukF変異体を作製し華僑実験を実施したが、目的としたタンパク質間相互作用の検出には至っていない。また、一本鎖DNA結合によりMukBの構造が変化するという仮説は、一本鎖DNA結合が低下したMukB変異体の分子内サプレッサー変異解析が一つの根拠となっている。2022年度はサプレッサー解析の実施を継続し、この仮説の基盤をより確かなものとした。

在这项研究中，我们旨在阐明与单链DNA区域结合的分子机制通过两个实验结合DNA：（a）通过与单链DNA结合的MUKBEF复合物检测DNA凝结，（B）（B）与单链DNA结合后MUKB结构状态的分析。在（a）和（b）中，都使用纯化的蛋白质使用大肠杆菌细胞和生化实验的实验，并且该方法是由体内和体外的。在2022财年，研究特别关注（b）中的实验。在实验（b）中，我们假设MUKB的DNA缩合遵循“单链DNA结合”→（MUKB中的结构变化）→“与MUKF”→“ DNA缩合”的相互作用，我们通过比较单链DNA结合的效果与MUK之间的MUK和MUK之间的效果进行比较。首先，我们试图通过检测MUKB和MUKF之间的相互作用以及MUKB二聚体的分子内相互作用，以及检查这些相互作用是否因减少单链DNA结合而改变了这些相互作用来分析MUKB的结构状态。使用位点特异性光叠链链接方法进行相互作用，该方法允许在氨基酸残基水平分辨率下检测蛋白质 - 蛋白质相互作用。尽管准备了位点特异性光链接实验所需的MUKB和MUKF突变体，并进行了海外中国实验，但尚未检测到靶蛋白 - 蛋白质相互作用。此外，单链DNA结合改变MUKB的结构是基于分子内抑制剂突变分析的假说，其单链DNA结合减少了MUKB突变体。在2022财年中，继续进行抑制分析，确保该假设的基础得到进一步巩固。