核磁気共鳴法を用いたGタンパク質共役型受容体によるアレスチン活性化機構の解明

使用核磁共振阐明 G 蛋白偶联受体的抑制蛋白激活机制

• 批准号: 22K15052
• 负责人: 白石 勇太郎
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15052/
• 关键词: Gタンパク質共役型受容体; アレスチン; 核磁気共鳴法; 核磁気共鳴分光法

完全作動薬であるformoterolが結合したβ2ARを調製し、GRK2によるリン酸化反応を行ったうえで、そのリン酸化部位をC tailを観測対象としたNMR測定により同定した。SPR法によりβ2ARとβ-アレスチン1の親和性を解析し、非リン酸化β2ARはβ-アレスチン1との結合が検出されない一方で、リン酸化β2ARではKd = 0.2 μMで結合することを示した。さらに、リン酸化β2ARに逆作動薬であるcarazololを結合させた際には、その親和性がKd > 1 μMに低下することを示した。以上の結果から、β2ARのC tailはリン酸化依存的に、TM coreは活性化依存的にβアレスチンと結合すること、特にリン酸化が見かけの親和性に大きく寄与していることが分かった。また、β-アレスチン1の構造変化をNMRシグナルの化学シフト変化を指標に解析しところ、formoterol結合型リン酸化β2ARの結合に伴い、β-アレスチン1のN,C lobe1の界面に特に大きな化学シフト変化が検出され、2つのローブの相対配置の変化を伴う構造変化が示唆された。一方で、carazolol結合型リン酸化β2ARが結合した際には、遊離状態に対応する化学シフト、folmoterol結合型リン酸化β2AR結合状態に対応する化学シフトの両方にシグナルが観測された。以上の結果から、β2ARの活性化したTM coreとの結合が、β-アレスチン1の構造変化に大きく寄与していることが分かった。さらに、β-アレスチン1の構造解析に用いられている構造認識抗体Fab30の結合がβ-アレスチン1の構造に与える影響を解析し、Fab30が結合すると、β2AR TM coreとの結合がない状態でも、β-アレスチン1が活性化構造を安定に形成することが分かった。

我们制备了与完全激动剂福莫特罗结合的β2AR，与GRK2进行磷酸化反应，并使用C尾作为观察目标通过NMR测量鉴定了磷酸化位点。我们使用 SPR 方法分析了 β2AR 和 β-arrestin 1 之间的亲和力，结果表明，虽然非磷酸化 β2AR 不与 β-arrestin 1 结合，但磷酸化 β2AR 与 Kd = 0.2 μM 结合。此外，当反向激动剂卡拉洛尔与磷酸化的β2AR结合时，其亲和力降低至Kd > 1 μM。上述结果表明，β2AR的C尾以磷酸化依赖性方式与β-arrestin结合，TM核心以激活依赖性方式与β-arrestin结合，并且磷酸化对表观亲和力的贡献尤其大。此外，我们以NMR信号中的化学位移变化为指标，分析了β-arrestin 1的结构变化，发现由于福莫特罗结合的磷酸化β2AR的结合，在N位发生了特别大的化学位移， β-arrestin 1 的 C lobe1 界面。检测到变化，表明结构变化涉及两个叶相对位置的变化。另一方面，当卡拉洛尔结合的磷酸化β2AR结合时，在对应于游离状态的化学位移和对应于福莫特罗结合的磷酸化β2AR的结合状态的化学位移中均观察到信号。从以上结果发现，β2AR与活化的TM核心的结合显着促进了β-arrestin 1的结构变化。此外，我们还分析了用于 β-arrestin 1 结构分析的结构识别抗体 Fab30 的结合对 β-arrestin 1 结构的影响。当 Fab30 结合时，即使没有与 β2AR 结合TM核心，我们发现β-arrestin 1稳定地形成活化结构。

项目成果

GPCRとの相互作用によるβ-アレスチン1の2段階活性

通过与 GPCR 相互作用两步激活 β-arrestin 1

• 发表时间: 2022
• 作者: 白石 勇太郎;幸福 裕;上田 卓見;Pandey Shubhi;Dwivedi-Agnihotri Hemlata;Shukla K. Arun;嶋田 一夫
• 通讯作者: 嶋田 一夫

Gタンパク質共役型受容体b2ARのリガンド依存的活性化機構

G蛋白偶联受体b2AR的配体依赖性激活机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 今井 駿輔;横溝 智貴;幸福 裕;白石 勇太郎;上田 卓見;嶋田 一夫
• 通讯作者: 嶋田 一夫

Function-Related Conformational Dynamics of GPCRs Revealed by Solution NMR

溶液 NMR 显示 GPCR 的功能相关构象动力学

• DOI: 10.5940/jcrsj.64.279
• 发表时间: 2022
• 期刊: Nihon Kessho Gakkaishi
• 作者: UEDA Takumi;KOFUKU Yutaka;TAKEUCHI Koh;IMAI Shunsuke;SHIRAISHI Yutaro;SHIMADA Ichio
• 通讯作者: SHIMADA Ichio

Structural equilibrium underlying ligand-dependent activation of b2-adrenoreceptor

b2-肾上腺素受体配体依赖性激活的结构平衡

• 发表时间: 2022
• 作者: Shunsuke Imai;Tomoki Yokomizo;Yutaka Kofuku;Yutaro Shiraishi;Takumi Ueda;Ichio Shimada
• 通讯作者: Ichio Shimada

アデノシンA2A受容体とリガンドの滞在時間を規定する構造基盤の解明

阐明决定腺苷 A2A 受体和配体停留时间的结构基础

• 发表时间: 2022
• 作者: Hisakazu Komori;Daichi Fujita;Yuma Shirasaki;Mayumi Arai,Qiunan Zhu;Ikumi Tamai;上田卓見，土田知輝，栗田政稔，水村拓也，今井駿輔，白石勇太郎，幸福裕，竹内恒，嶋田一夫
• 通讯作者: 上田卓見，土田知輝，栗田政稔，水村拓也，今井駿輔，白石勇太郎，幸福裕，竹内恒，嶋田一夫