ゲノム編集技術を用いたインフルエンザウイルス抵抗性ニワトリの作製に向けた研究

利用基因组编辑技术培育抗流感病毒鸡的研究

基本信息

批准号：
22K15027
负责人：
奥嵜雄也
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

インフルエンザウイルス抵抗性を示すニワトリの作出にあたり、本年度の研究ではウイルス耐性遺伝子候補の取得を目的としたCRISPR-Cas9を用いたスクリーニングを行うためのシステムを構築した。ニワトリ遺伝子を対象としたCRISPR-Cas9 gRNAライブラリは存在したいため、まずgRNAライブラリの構築を試みた。データベース上にアノテーションが存在する14000種類のニワトリ遺伝子のタンパク質コード領域を対象とし、各遺伝子に対してCRISPR-Cas9 gRNAの標的配列をそれぞれ6つずつin silicoで設計した。次いでこれら標的配列をカスタムマイクロアレイ上に合成し、PCRにより二重鎖DNAへリカバリーした後gRNA発現用レンチウイルスベクターへとクローニングを行うことでgRNAライブラリを作製した。また、並行してインフルエンザウイルスの感染実験に用いるニワトリ線維芽細胞DF1に対して、piggyBacトランスポゾンベクターを用いて恒常的もしくはテトラサイクリン依存的にCas9タンパク質を発現する安定発現株の樹立を行った。さらに作製した安定発現株をクローン化し、Cas9によるゲノム編集効率が高い株を選抜した。今後これらの材料を用いてインフルエンザウイルス耐性遺伝子のスクリーニングを進める予定である。本研究は世界で初めてニワトリの全遺伝子を対象としたgRNAライブラリを作製した。ニワトリは食肉や食用卵の生産に重要な家禽であり、また鳥類モデル生物として発生学などの基礎生物学においても広く用いられている。本研究で作製したgRNAライブラリは育種や発生学を目的としたCRISPRスクリーニングにも適応可能であり、したがって遺伝子工学的ツールとしても汎用性の高い有益なものだと考えらえる。

在今年的研究中，我们利用CRISPR-Cas9构建了筛选系统，以获得候选病毒抗性基因，以培育出对流感病毒有抵抗力的鸡。由于我们想要一个针对鸡基因的 CRISPR-Cas9 gRNA 文库，因此我们首先尝试构建 gRNA 文库。针对数据库中注释的 14,000 个鸡基因的蛋白质编码区，我们在计算机上为每个基因设计了 6 个 CRISPR-Cas9 gRNA 靶序列。接下来，这些靶序列在定制微阵列上合成，通过 PCR 恢复成双链 DNA，然后克隆到慢病毒载体中进行 gRNA 表达，以创建 gRNA 文库。与此同时，我们使用piggyBac转座子载体建立了稳定的表达系，该表达系在流感病毒感染实验中使用的鸡成纤维细胞DF1中组成型或四环素依赖性表达Cas9蛋白。此外，我们克隆了我们创建的稳定表达菌株，并使用 Cas9 选择了具有高基因组编辑效率的菌株。未来，我们计划利用这些材料来筛选流感病毒抗性基因。这项研究是世界上第一个针对所有鸡基因创建 gRNA 文库的研究。鸡是生产肉和食用蛋的重要家禽，也广泛用作胚胎学等基础生物学中的禽类模式生物。本研究创建的gRNA文库可应用于育种和胚胎学目的的CRISPR筛选，因此被认为是一种高度通用且有用的基因工程工具。