ゲノム編集技術を用いたインフルエンザウイルス抵抗性ニワトリの作製に向けた研究

利用基因组编辑技术培育抗流感病毒鸡的研究

基本信息

批准号：
22K15027
负责人：
奥嵜雄也
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

インフルエンザウイルス抵抗性を示すニワトリの作出にあたり、本年度の研究ではウイルス耐性遺伝子候補の取得を目的としたCRISPR-Cas9を用いたスクリーニングを行うためのシステムを構築した。ニワトリ遺伝子を対象としたCRISPR-Cas9 gRNAライブラリは存在したいため、まずgRNAライブラリの構築を試みた。データベース上にアノテーションが存在する14000種類のニワトリ遺伝子のタンパク質コード領域を対象とし、各遺伝子に対してCRISPR-Cas9 gRNAの標的配列をそれぞれ6つずつin silicoで設計した。次いでこれら標的配列をカスタムマイクロアレイ上に合成し、PCRにより二重鎖DNAへリカバリーした後gRNA発現用レンチウイルスベクターへとクローニングを行うことでgRNAライブラリを作製した。また、並行してインフルエンザウイルスの感染実験に用いるニワトリ線維芽細胞DF1に対して、piggyBacトランスポゾンベクターを用いて恒常的もしくはテトラサイクリン依存的にCas9タンパク質を発現する安定発現株の樹立を行った。さらに作製した安定発現株をクローン化し、Cas9によるゲノム編集効率が高い株を選抜した。今後これらの材料を用いてインフルエンザウイルス耐性遺伝子のスクリーニングを進める予定である。本研究は世界で初めてニワトリの全遺伝子を対象としたgRNAライブラリを作製した。ニワトリは食肉や食用卵の生産に重要な家禽であり、また鳥類モデル生物として発生学などの基礎生物学においても広く用いられている。本研究で作製したgRNAライブラリは育種や発生学を目的としたCRISPRスクリーニングにも適応可能であり、したがって遺伝子工学的ツールとしても汎用性の高い有益なものだと考えらえる。

在表现出流感病毒抗性的鸡的生产中，今年的研究构建了使用CRISPR-CAS9进行筛查的系统，该系统旨在获得候选病毒抗性基因。由于我们想拥有一个针对鸡基因的CRISPR-CAS9 GRNA库，因此我们首先试图构建一个GRNA库。在每个基因的硅中设计了六个目标序列的CRISPR-CAS9 GRNA，靶向14,000个鸡基因的蛋白质编码区，并在数据库中存在注释。然后将这些目标序列在自定义微阵列上合成，通过PCR恢复至双链DNA，然后克隆到慢病毒载体中以进行GRNA表达，从而产生GRNA库。此外，同时，使用Piggybac Transposon载体载体或四环素依赖性地依赖于PiggyBac Transposon载体，并建立了用于鸡成纤维细胞DF1的稳定表达Cas9蛋白，该蛋白用于鸡成纤维细胞DF1。此外，将制备的稳定表达应变克隆，并选择具有CAS9的高基因组编辑效率的应变。将来，我们计划使用这些材料进行筛查，以筛查流感病毒抗性基因。这项研究创建了世界上第一个针对所有鸡基因的GRNA库。鸡是生产肉类和可食用鸡蛋的重要家禽，也被广泛用作基本生物学（例如胚胎学）中的模型鸟类生物。这项研究中生产的GRNA库可以适应CRISPR筛查的育种和胚胎学，因此可以被视为一种多功能且有用的基因工程工具。