力学的及び電気生理学的に成熟型となる心筋組織のin vitro培養法の確立

机械和电生理成熟心肌组织体外培养方法的建立

• 批准号: 21K16494
• 负责人: 笹井 雅夫
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K16494/
• 关键词: 心筋成熟化; 回転浮遊培養; 培養法開発; 心筋; 成熟化

人工多能性幹細胞（iPSC）から分化誘導された心筋細胞は未熟型であることから、当該心筋細胞を薬剤評価に活用したり、再生医療として細胞治療に用いたりと、適した細胞の性質を有しているかどうかは疑義が生じる状態である。本研究では心筋成熟の培養法の開発を目指して、２つの培養法を複合させる条件検討及び評価に取組んだ。１つは心筋細胞が環状となる培養によりTraveling wave（TW）を引き起こし、電気的な刺激により成熟を促す方法と、回転浮遊培養によるShear stress（SS)を与え、物理的な刺激により成熟を促す方法である。両者を組み合わせて成熟をより促すことができるかを検討した。なお、コントロールとして、心筋細胞が環状とならない培養基材を用いた培養も同時に並行させた。検討条件として、TWを引き起こす培養及び培養期間を経て、その後、回転浮遊培養によるSSを与える培養プロセスにより、得られた細胞の特性を評価した。培養基材にはポリ乳酸コグリコール酸（PLGA）のナノファイバーを用いた。PLGAナノファイバー上に、iPSC由来心筋細胞（cTnT陽性細胞率として64.2％～91.2％）を播種し、3,5,7日後にMotion Analyzerによる拍動の解析（拍動回数、収縮及び弛緩の程度）を行った。7日後に回転浮遊培養系へ移行し、1週間の回転浮遊培養を行った。培養細胞を取り出し、ELISA、形態観察（免疫染色）、電子顕微鏡観察、細胞代謝物プロファイリングによって心筋成熟度の評価を行った。その結果、拍動に関してTWを引き起こすことで拍動回数と収縮速度の向上傾向が見られた。一方でサイトカイン産生能は類似しており、大きな変化が見られなかった。細胞代謝物プロファイリングではSSを加えることで細胞内のGlucoseやTCA回路に関連する因子が多く検出されたことから、心筋成熟が示唆された。

由于由诱导多能干细胞（iPSC）诱导分化的心肌细胞尚未成熟，因此有必要开发合适的细胞特性，例如利用心肌细胞进行药物评价或作为再生医学的细胞疗法。 。在本研究中，为了开发心肌成熟的培养方法，我们研究并评估了两种培养方法相结合的条件。一种方法是通过将心肌细胞培养成圆形来诱导行波（TW）并通过电刺激促进成熟，另一种方法是通过旋转悬浮培养物施加剪切应力（SS）并通过物理刺激促进成熟。 。我们研究了是否有可能通过将两者结合起来进一步促进成熟。作为对照，还平行地进行使用心肌细胞不形成环的培养基质的培养。作为研究条件，我们评估了通过培养和引起TW的培养时间、然后通过旋转悬浮培养给予SS的培养过程获得的细胞的特性。聚乳酸共乙醇酸（PLGA）纳米纤维用作培养基质。将 iPSC 衍生的心肌细胞（cTnT 阳性细胞率：64.2% 至 91.2%）接种在 PLGA 纳米纤维上，3、5 和 7 天后，使用运动分析仪分析脉动（拍频、收缩程度和松弛程度） ））进行了。 7天后，将培养物转移至旋转悬浮培养系统，旋转悬浮培养1周。取出培养的细胞，通过ELISA、形态学观察（免疫染色）、电子显微镜和细胞代谢物分析评估心肌成熟度。结果，我们发现针对脉动诱导 TW 往往会提高脉动次数和收缩速度。另一方面，细胞因子的产生能力相似，没有观察到重大变化。通过添加 SS，细胞代谢物分析检测到许多与细胞内葡萄糖和 TCA 循环相关的因素，表明心肌成熟。