シナプス前部からの直接パッチクランプ記録によるカンナビノイドの作用点の解析

通过突触前区域直接膜片钳记录分析大麻素的作用位点

基本信息

批准号：
21K15189
负责人：
井下拓真
金额：
$ 3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度は、近年同定された第三のカンナビノイド受容体（GPR55）が小脳プルキンエ細胞出力シナプスにおいてシナプス伝達を抑制することを明らかにした。また、シナプス伝達抑制の際に、シナプス前終末へのCa2+流入に有意な差は認められず、Ca2+流入以降の伝達物質放出の過程にこの受容体が影響することが示唆された。一方で、これまでよく調べられているカンナビノイド受容体（CB1、CB2）のアゴニストはプルキンエ細胞からの出力を変化させなかった。今年度は、GPR55の内因性アゴニストやアンタゴニストを用いた実験を行い、プルキンエ細胞出力が実際にGPR55によって抑制されることを確かめた。また、小脳切片でも同様にGPR55がシナプス伝達を減弱させることを発見した。GPR55がシナプス伝達を減弱させるメカニズムとして、シナプス前終末の即時放出可能なシナプス小胞の総数をGPR55が減少させることを明らかにした。また、GPR55によるシナプス伝達減弱の程度はパッチピペット内液のEGTAの濃度には影響されなかった。これらの結果は、これまで予想されていたCB1、CB2がシナプス伝達を抑制する仕組みとは異なる、シナプス伝達調節の新しい仕組みの存在を示唆している。一方で、CB2について免疫染色を行ったところ、CB2のシグナルが小脳プルキンエ細胞の細胞体や樹状突起には認められるが軸索にはほとんど認められなかった。そこで、CB2が確実に軸索に存在するようアデノ随伴ウイルスによってCB2を過剰発現させた。CB2過剰発現プルキンエ細胞ではCB2アゴニストがシナプス伝達を抑制した。このとき、シナプス前部へのCa2+流入が減弱しており、即時放出可能なシナプス小胞の総数には差が認められなかった。これらの結果により、Ca2+イメージングにより予測されていたシナプス伝達抑制のメカニズムを直接証明することができた。

去年，我们发现最近发现的第三种大麻素受体（GPR55）可抑制小脑浦肯野细胞输出突触的突触传递。此外，当突触传递受到抑制时，突触前末端的Ca2+流入没有观察到显着差异，表明该受体影响Ca2+流入后递质释放的过程。另一方面，迄今为止已得到充分研究的大麻素受体（CB1和CB2）激动剂并没有改变浦肯野细胞的输出。今年，我们使用GPR55的内源性激动剂和拮抗剂进行了实验，并证实浦肯野细胞输出实际上被GPR55抑制。他们还发现 GPR55 同样减弱小脑切片中的突触传递。作为 GPR55 减弱突触传递的机制，我们发现 GPR55 减少了突触前末端可立即释放的突触小泡的总数。此外，GPR55对突触传递的减弱程度不受贴片移液管溶液中EGTA浓度的影响。这些结果表明存在一种调节突触传递的新机制，该机制不同于之前预测的CB1和CB2抑制突触传递的机制。另一方面，当进行CB2的免疫染色时，在小脑浦肯野细胞的细胞体和树突中观察到CB2信号，但在轴突中几乎未检测到CB2信号。因此，我们使用腺相关病毒过表达CB2，以确保CB2存在于轴突中。 CB2 激动剂抑制 CB2 过度表达的浦肯野细胞中的突触传递。此时，Ca2+流入突触前的量减弱，并且可以立即释放的突触小泡总数没有观察到差异。这些结果直接证明了Ca2+成像预测的突触传递抑制机制。