Functional and Structural Relationship of V-ATPase Revealed by Single-Molecule Observation

单分子观察揭示V-ATP酶的功能和结构关系

基本信息

批准号：
21K15060
负责人：
大友章裕
金额：
$ 3万
依托单位：
Institute for Molecular Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

回転型ATPaseは生物に普遍的に存在する分子モータータンパク質であり、ATPの化学結合エネルギーと膜間の電気化学ポテンシャルとを回転運動を介して共役している最小のエネルギー変換装置として知られている。本研究ではその中でもナトリウムイオンを選択的に輸送する腸球菌由来V-ATPaseを用い、その回転機構および反応機構の解明を目指している。2022年度は精製したV-ATPaseの１分子回転計測によりATP加水分解部位とイオン輸送部位との共役機構の一端を明らかにし、その成果を原著論文として発表した。実験の過程でイオン選択性に寄与していると考えられるアミノ酸残基を同定しそれらを変異させることで、腸球菌由来V-ATPaseをナトリウムイオン輸送型からプロトン輸送型に機能転換させることに成功した。この機能転換した変異体の生化学評価および１分子回転挙動を詳細に調べることで、回転型ATPaseにおけるイオン輸送機構の解明が期待できる。並行して、腸球菌由来V-ATPaseの反応可逆性を検証するための生化学測定系およびスクリーニング系の立ち上げ中である。また人工小胞体を用いたナトリウムイオン輸送の定量実験にも取り組んでおり、これら各種生化学測定と１分子回転計測とを組み合わせることで、V-ATPaseの機能と連動した構造ダイナミクス解明を目指す。

旋转ATP酶是一种普遍存在于生物体中的分子运动蛋白，被称为通过旋转运动将ATP的化学键能与膜间电化学势耦合的最小能量转换装置。在本研究中，我们旨在阐明选择性转运钠离子的肠球菌 V-ATP 酶的旋转和反应机制。 2022年，我们通过测量纯化的V-ATP酶的单分子旋转，阐明了ATP水解位点和离子转运位点之间的部分缀合机制，并将结果作为原创论文发表。通过在实验过程中鉴定和突变被认为有助于离子选择性的氨基酸残基，我们成功地将肠球菌 V-ATP 酶的功能从钠离子转运型转变为质子转运型。通过对这种功能转换突变体的生化评估和对单分子旋转行为的详细研究，我们有望阐明旋转 ATP 酶中的离子传输机制。与此同时，我们正在启动生化测量系统和筛选系统，以验证肠球菌 V-ATP 酶反应的可逆性。我们还致力于使用人工内质网进行钠离子转运的定量实验，并通过将这些各种生化测量与单分子旋转测量相结合，我们的目标是阐明与 V-ATP 酶功能相关的结构动力学。