卵子型エピゲノム形成におけるH3K36メチル化酵素ファミリーの機能解明

H3K36 甲基转移酶家族在卵母细胞型表观基因组形成中的功能阐明

• 批准号: 21K15000
• 负责人: 佐々木 恵亮
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15000/
• 关键词: 卵; エピジェネティクス; ヒストン修飾; ゲノム編集; 卵子; microRNA; RNA干渉

H3K36メチル化酵素遺伝子の冗長性を検証するための卵特異的多重ノックダウンマウスは現在作成中である。これまではゲノム編集によって卵特異的に発現する遺伝子のイントロンに人工的に配列をデザインしたマイクロRNA様配列（amiRNA）をノックインする戦略をとっていたが、遺伝子ノックダウン効率に問題が生じる可能性が考えられた。現在はamiRNAのコピー数を増加させてより強力なサイレンシング効果を得るという意図のもと、卵特異的にamiRNAを発現可能なベクター系を構築し、これを用いたトランスジェニックマウスを作成している。H3K36メチル化酵素遺伝子を欠失させた単一遺伝子のノックアウトマウス作出にも着手した。まずは遺伝子欠損による致死性の報告がないNsd3のノックアウトマウスを作成し、複数ラインのノックアウトマウスが樹立できた。現在は交配によりホモノックアウトを作成中である。Nsd1、Nsd2およびSetd2については卵特異的に遺伝子阻害をする必要があるため、コンディショナルノックアウトかamiRNAによる卵特異的ノックダウンのいずれかを検討している。また、本研究ではCUT&RUNによるヒストン修飾の全ゲノムプロファイルを実施する予定であったが、CUT&RUNよりもローインプットなCUT&Tag法に切り替えた。ライブラリ調製にあたっては、常法を改変して細胞吸着磁気ビーズフリーかつ成長完了卵に適したプロトコルを確立できた。野生型マウス卵を用いてヒストンH3における36番目のリジン残基のトリメチル化（H3K36me3）およびH3K27me3修飾について、現在シークエンス解析中である。

目前正在构建鸡蛋特异性多重敲低小鼠，以验证 H3K36 甲基转移酶基因的冗余性。到目前为止，策略是通过基因组编辑将人工设计的类似微小RNA的序列（amiRNA）敲入鸡蛋中特异性表达的基因的内含子中，但这有可能导致考虑了基因敲除效率的问题。目前，为了增加amiRNA的拷贝数以获得更强的沉默效果，我们正在构建能够在卵中特异性表达amiRNA的载体系统，并利用该载体系统创建转基因小鼠。我们还开始创建缺乏 H3K36 甲基转移酶基因的单基因敲除小鼠。首先，他们创建了 Nsd3 基因敲除小鼠，目前还没有因基因删除而致死的报道，并且能够建立多个基因敲除小鼠品系。目前，纯合基因敲除正在通过杂交产生。由于需要以卵特异性方式抑制 Nsd1、Nsd2 和 Setd2 基因，因此我们正在考虑使用 amiRNA 进行条件敲除或卵特异性敲除。此外，在本研究中，我们原计划使用 CUT&RUN 进行组蛋白修饰的全基因组分析，但我们改用了 CUT&Tag 方法，该方法的输入量比 CUT&RUN 低。对于文库制备，我们修改了常规方法，建立了不含细胞吸附磁珠且适合完全生长的卵的方案。我们目前正在使用野生型小鼠卵对组蛋白 H3 中第 36 个赖氨酸残基 (H3K36me3) 的三甲基化和 H3K27me3 修饰进行序列分析。

项目成果

転写因子Cdx2の下方制御はマウス壁栄養外胚葉の分化及び胚盤胞のoutgrowthに必要である

小鼠壁层滋养外胚层分化和囊胚生长需要转录因子 Cdx2 的下调

• 发表时间: 2022
• 作者: 鈴木 大介;佐々木 恵亮;小川 英彦
• 通讯作者: 小川 英彦