Development of artificial nucleic acid aptamers to improve the efficacy of antisense oligonucleotide

开发人工核酸适体以提高反义寡核苷酸的功效

• 批准号: 21K14743
• 负责人: 笠原 勇矢
• 金额: $ 3万
• 依托单位: National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K14743/
• 关键词: アプタマー; アンチセンス核酸; 核酸医薬; DDS; SELEX

核酸医薬の一つであるアンチセンス核酸（ASO）が抱える課題として肝臓以外の臓器（細胞）へのデリバリーがあげられる。ASOを肝臓以外の臓器に効率的に送達し機能を発揮させるデリバリー担体として、同じ核酸分子であるアプタマーに着目した。アプタマーは抗体のように標的分子に特異的に結合することができる1本鎖の核酸分子であり、SELEX法と呼ばれる選別方法によって望みの機能を持ったものを効率的に取得できる特徴がある。本研究では、ASOの機能を指標としたSELEXによって、目的の臓器（細胞）への送達効率だけでなくASOの機能も向上可能なアプタマーの創出を試みる。得られたアプタマーを培養細胞での機能評価だけでなく実験動物における送達効率や治療効果を検証することでその有用性を評価する。なお、アプタマーの核酸分解酵素に対する安定性を向上させるための糖部修飾と、親和性を向上するための塩基部修飾を組み合わせた塩基部/糖部デュアル修飾型人工核酸を利用する。令和4年度（2022年度）は、SELEXに使用するライブラリを構築する際の各種反応条件（酵素濃度、三リン酸体濃度、テンプレート濃度、Mn2+濃度、反応温度・時間）を精査することで、酵素合成の反応効率を2倍程度向上できる条件を見出した（天然型のDNAとほぼ同程度の反応効率）。また、ライブラリ構築およびスクリーニング時に使用する塩基部/糖部デュアル修飾型人工核酸三リン酸体（2'-OMe-Utrp-TP）を合成する際の鍵反応であるHeck反応によるウラシル5位へのリンカー構造の導入について、反応条件を精査することで、収率を2倍程度向上させる条件を見出した。

反义核酸（ASO）是核酸药物的一种，面临的挑战之一是将其输送到肝脏以外的器官（细胞）。我们重点研究适体（类似核酸分子）作为递送载体，将ASO有效递送至肝脏以外的器官并发挥其功能。适体是能够与抗体等靶分子特异性结合的单链核酸分子，其特点是可以通过称为SELEX法的选择方法有效地获得具有所需功能的核酸分子。在本研究中，我们将尝试创建一种适体，该适体不仅可以提高向靶器官（细胞）的递送效率，而且可以使用以ASO功能为指标的SELEX来提高ASO的功能。所获得的适体的有用性不仅可以通过培养细胞中的功能评估来评估，还可以通过在实验动物中验证递送效率和治疗效果来评估。此外，采用碱基/糖基双重修饰的人工核酸，结合糖基修饰以提高适配体对核酸切割酶的稳定性，并结合碱基修饰以提高亲和力。 2022年，我们将在构建用于SELEX的文库时仔细检查各种反应条件（酶浓度、三磷酸浓度、模板浓度、Mn2+浓度、反应温度和时间），我们发现了可以将酶合成的反应效率提高约的条件。两次（反应效率与天然DNA几乎相同）。此外，Heck反应是合成用于文库构建和筛选的碱基/糖部分双重修饰的人工三磷酸核酸（2'-OMe-Utrp-TP）时的关键反应，在5-位进行。通过仔细检查引入连接体结构的反应条件，他们发现了使产量翻倍的条件。

项目成果

糖・塩基部デュアル修飾型人工核酸を用いた抗CHIP/STUB1アプタマーの創出

利用糖/碱基双修饰人工核酸构建抗CHIP/STUB1适体

• 发表时间: 2023
• 作者: Ohtsuka Hokuto;Hatta Yoshiko;Hayashi Kana;Shimasaki Takafumi;Otsubo Yoko;Ito Yurika;Tsutsui Yu;Hattori Nobutake;Yamashita Akira;Murakami Hiroshi;Aiba Hirofumi;石田健太，千賀陽子，仁田峠海斗，岡正啓，大岡伸通，星野秀和，出水庸介，井上貴雄，小比賀聡，笠原勇矢
• 通讯作者: 石田健太，千賀陽子，仁田峠海斗，岡正啓，大岡伸通，星野秀和，出水庸介，井上貴雄，小比賀聡，笠原勇矢

ポリアミンによる人工核酸の酵素伸長への影響

多胺对人工核酸酶促延伸的影响

• 发表时间: 2022
• 作者: 星野秀和;笠原勇矢;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡

塩基部修飾人工核酸を用いた抗IL-6Rアプタマーの開発

使用碱基修饰的人工核酸开发抗IL-6R适体

• 发表时间: 2022
• 作者: 笠原勇矢;千賀陽子;石田健太;奥田匠;長尾知生子;新山真由美;鎌田春彦;水口賢司;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡

2′位や5′位を修飾した人工核酸の改変ポリメラーゼによる酵素伸長

使用修饰聚合酶对 2 和 5 位置修​​饰的人工核酸进行酶促延伸

• 发表时间: 2022
• 作者: 石田健太;笠原勇矢;星野秀和;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡

ランダム領域を拡張した修飾オリゴヌクレオチドの酵素合成

具有扩展随机区域的修饰寡核苷酸的酶法合成

• 发表时间: 2023
• 作者: 仁田峠海斗;石田健太;星野秀和;笠原勇矢;小比賀聡
• 通讯作者: 小比賀聡