活性型Ａｌｕ検出によるゲノム動的地図の作成

通过检测活性Alu创建基因组动态图

基本信息

批准号：
24651220
负责人：
山田思郎
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2014-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24651220/
关键词：
繰り返し配列 Alu ゲノム進化と疾病

项目摘要

平成２４年度に行った実験より、Aluのサブクラスを特異的に増幅することは難しいことが分かった。サブクラス同士が非常に似た配列であり、かつグアニン・シトシン塩基の割合が多いためと思われた。PCRプライマーの設定を繰り返した。アニーリング温度を高めに設定すること、プライマーの解離温度を高めにすることを試みたが、最適な条件はいまだ決まっていない。MAC-PCR法で見つかる新規Alu配列挿入の確認のために、Achレセプター遺伝子を含む染色体領域のPCR増幅を行い成功した。増幅断片は制限酵素にて切断を行い、レファレンス配列から予想される通りの断片長を得た。将来的に、新規挿入Aluが見つかった場合には、挿入の有無をこの方法で確認することができる。新規挿入Aluとその周辺塩基配列が決定された場合には、その配列の染色体上の座位を決定し、データベースのものと比較する必要がある。Alu配列はハプロイドあたり１００万個と大量にあるため、検出されるAluも多種多量となる。このデータ処理のため、コンピュータを購入し基準となるゲノムデータをダウンロードした。また、クラウドソフトのGalaxy（https://main.g2.bx.psu.edu/）を用いてデータベースからのAlu等、繰り返し配列の全ゲノム情報をダウンロードできようにした。繰り返し配列の医学的な研究は世界的にも始まったばかりである。ゲノムの４割を占める繰り返し配列の進化的な意義が今後明らかになると、疾病と繰り返し配列の関連も分かってくる。繰り返し配列の挿入による遺伝子破壊だけでなく、ゲノム全体の制御を変化させる仕組みも疾病に関わることが明らかになるであろう。今回の研究は研究者の転勤に伴い一旦終了するが、ここで得られたノウハウを用いて新規挿入Aluと疾患の関連性に関して引き続き別施設で研究を継続する予定である。

2012年进行的实验表明，特异性扩增Alu的子类是很困难的。这似乎是因为这些亚类具有非常相似的序列以及高比例的鸟嘌呤和胞嘧啶碱基。重复 PCR 引物设置。我们尝试设置较高的退火温度并提高引物的解离温度，但最佳条件尚未确定。为了证实MAC-PCR检测到的新Alu序列插入，我们成功地对含有Ach受体基因的染色体区域进行了PCR扩增。用限制性酶切割扩增的片段以获得与参考序列预期的片段长度。如果将来发现新插入的Alu，则可以使用该方法确认是否存在插入。当新插入的Alu及其周围碱基序列确定后，需要确定该序列的染色体位点，并与数据库中的进行比对。由于Alu序列数量巨大，每个单倍体多达100万个，因此可以检测到许多不同类型的Alu。为了处理这些数据，我们购买了一台计算机并下载了标准基因组数据。此外，我们还可以使用云软件Galaxy（https://main.g2.bx.psu.edu/）从数据库中下载重复序列（例如Alu）的全基因组信息。关于重复序列的医学研究在全世界才刚刚开始。随着占基因组 40% 的重复序列的进化意义变得更加清晰，我们也将能够理解疾病和重复序列之间的关系。很明显，疾病不仅涉及插入重复序列引起的基因破坏，而且改变整个基因组控制的机制也与疾病有关。尽管由于研究人员的调动，这项研究将暂时终止，但我们计划利用在这里获得的技术知识，在其他设施中继续研究新插入的 Alu 与疾病之间的关系。