Single-cell analysis of osteoblast and chondrocyte differentiation control mechanism by Runx2 enhancer

Runx2增强子对成骨细胞和软骨细胞分化控制机制的单细胞分析

• 批准号: 22KJ2504
• 负责人: 松裏 恵子
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2504/
• 关键词: Runx2; 骨芽細胞分化; 軟骨細胞分化; エンハンサー

Runx2は、軟骨細胞と骨芽細胞分化の両者に必須な転写因子である。Runx2遺伝子の発現制御機構を明らかにするため、分化に伴うRunx2遺伝子のエンハンサー領域の変化を調べた。その方法として、活性化したエンハンサー領域は、オープンクロマチン構造を取るため、オープンクロマチン領域を検出するATACシークエンスを採用した。まず、バックグラウンドを下げるために、ATACシークエンスのDNA調整の条件を決定した。軟骨細胞に関しては、初期培養軟骨細胞のマイクロマス培養を行った。各培養期間でアルシアンブルー染色およびRNAを抽出、II型コラーゲン、アグリカン、インディアンヘッジホグ、Runx2、X型コラーゲン、オステオポンチン、Mmp13のmRNA発現を調べた。アルシアンブルー染色の強度及びこれらの遺伝子の発現レベルにより、未熟軟骨細胞、成熟軟骨細胞、終末期肥大軟骨細胞の３分化段階を設定し、それぞれの分化段階でDNAを調整し、ATACシークエンスを行った。同様に頭蓋冠から得た初期培養骨芽細胞を分化誘導することにより、骨芽細胞の各分化段階でのオープンクロマチン領域をATACシークエンスにより解析した。ATACシークエンスは、外注したが、そのデータ解析は自分で行った。これまでRunx2のエンハンサー候補15領域を解析してきたが、今回の実験で、軟骨細胞特異的、骨芽細胞特異的あるいは両者で活性化されているエンハンサーが存在することが示唆された。さらに、分化段階で活性化の異なるエンハンサーが存在することも示唆された。現在、軟骨細胞特異的、骨芽細胞特異的、あるいは両者ともに活性化されたエンハンサーか、さらに分化段階によってその活性が異なるかを、それぞれのエンハンサー候補とミニマルプロモーターを用いたGFPレポーターマウスを作製し、検証している。

Runx2 是软骨细胞和成骨细胞分化所必需的转录因子。为了阐明 Runx2 基因的表达控制机制，我们研究了 Runx2 基因增强子区域在分化过程中的变化。作为一种方法，我们采用了 ATAC 测序，该测序可检测开放染色质区域，因为激活的增强子区域采用开放染色质结构。首先，为了降低背景，确定了ATAC测序的DNA调整条件。对于软骨细胞，对最初培养的软骨细胞进行微团培养。在每个培养时期，进行阿尔新蓝染色和RNA提取以检查II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖、Indian Hedgehog、Runx2、X型胶原蛋白、骨桥蛋白和Mmp13的mRNA表达。根据阿尔辛蓝染色的强度和这些基因的表达水平，设定三个分化阶段：未成熟软骨细胞、成熟软骨细胞和终末肥大软骨细胞，并在每个分化阶段进行DNA测序。类似地，通过诱导从颅盖获得的早期培养成骨细胞的分化，通过ATAC测序分析成骨细胞每个分化阶段的开放染色质区域。 ATAC序列是外包的，但数据分析是我自己做的。到目前为止，我们已经分析了 Runx2 的 15 个潜在增强子区域，该实验表明存在在软骨细胞、成骨细胞或两者中被激活的增强子。此外，有人提出，增强子在不同的分化阶段被不同地激活。目前，我们正在使用每种增强子候选物和最小启动子来生成 GFP 报告小鼠，以确定增强子是否是软骨细胞特异性、成骨细胞特异性或两者都激活的，以及活性是否因分化阶段而异，已得到验证。