Single-cell analysis of osteoblast and chondrocyte differentiation control mechanism by Runx2 enhancer

Runx2增强子对成骨细胞和软骨细胞分化控制机制的单细胞分析

• 批准号: 22KJ2504
• 负责人: 松裏 恵子
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2504/
• 关键词: Runx2; 骨芽細胞分化; 軟骨細胞分化; エンハンサー

Runx2は、軟骨細胞と骨芽細胞分化の両者に必須な転写因子である。Runx2遺伝子の発現制御機構を明らかにするため、分化に伴うRunx2遺伝子のエンハンサー領域の変化を調べた。その方法として、活性化したエンハンサー領域は、オープンクロマチン構造を取るため、オープンクロマチン領域を検出するATACシークエンスを採用した。まず、バックグラウンドを下げるために、ATACシークエンスのDNA調整の条件を決定した。軟骨細胞に関しては、初期培養軟骨細胞のマイクロマス培養を行った。各培養期間でアルシアンブルー染色およびRNAを抽出、II型コラーゲン、アグリカン、インディアンヘッジホグ、Runx2、X型コラーゲン、オステオポンチン、Mmp13のmRNA発現を調べた。アルシアンブルー染色の強度及びこれらの遺伝子の発現レベルにより、未熟軟骨細胞、成熟軟骨細胞、終末期肥大軟骨細胞の３分化段階を設定し、それぞれの分化段階でDNAを調整し、ATACシークエンスを行った。同様に頭蓋冠から得た初期培養骨芽細胞を分化誘導することにより、骨芽細胞の各分化段階でのオープンクロマチン領域をATACシークエンスにより解析した。ATACシークエンスは、外注したが、そのデータ解析は自分で行った。これまでRunx2のエンハンサー候補15領域を解析してきたが、今回の実験で、軟骨細胞特異的、骨芽細胞特異的あるいは両者で活性化されているエンハンサーが存在することが示唆された。さらに、分化段階で活性化の異なるエンハンサーが存在することも示唆された。現在、軟骨細胞特異的、骨芽細胞特異的、あるいは両者ともに活性化されたエンハンサーか、さらに分化段階によってその活性が異なるかを、それぞれのエンハンサー候補とミニマルプロモーターを用いたGFPレポーターマウスを作製し、検証している。

Runx2是软骨细胞和成骨细胞分化的基本转录因子。为了阐明Runx2基因的表达调节机理，我们研究了分化后Runx2基因增强子区域的变化。作为一种方法，采用ATAC序列来检测开放染色质区域，因为活化的增强剂区域具有开放的染色质结构。首先，确定ATAC序列的DNA调节条件以减少背景。关于软骨细胞，软骨细胞的初始培养受到微瘤培养。在每个培养期提取Alcian蓝色染色和RNA，并检查了II型胶原蛋白，Aggrecan，Indian Hedgehog，Runx2，胶原蛋白，骨桥蛋白和MMP13的mRNA表达。 Alcian蓝色染色的强度和这些基因的表达水平允许在每个区分阶段和ATAC序列进行调整的未成熟软骨细胞，成熟的软骨细胞和末端肥大软骨细胞的三分化阶段。类似地，通过诱导从瓦尔瓦里亚获得的早期培养成骨细胞的分化，通过ATAC测序分析了成骨细胞分化的每个阶段的开放染色质区域。 ATAC序列被外包了，但是数据分析是由我自己进行的。我们先前已经分析了15个候选区域的Runx2增强剂，在该实验中，有人建议有一些增强剂，它们都是软骨细胞特异性，成骨细胞特异性或激活的。此外，有人提出在分化阶段存在激活的差异增强子。当前，使用每个增强子候选者和最小启动子的GFP报告基因小鼠正在生产和验证，以查看它们是软骨细胞特异性，成骨细胞特异性的还是两者都被激活的，以及它们的活性取决于差异阶段。